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實驗目的：
       1.了解并掌握原代細胞培養(yǎng)的相關原理
       2.了解并掌握小鼠肝細胞原代培養(yǎng)的方法
實驗器材：
       二氧化碳培養(yǎng)箱、光學顯微鏡、無菌操作臺、恒溫水浴鍋、酒精燈、培養(yǎng)皿、燒杯、鑷子、酒精棉、離心管、電動移液器、移液管、細胞計數(shù)板、幼鼠、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、0.125%胰蛋白酶(含0.1%膠原酶) 、D-Hanks或者PBS等。

       原代培養(yǎng)是從供體中取得組織或細胞后在體外進行的培養(yǎng)。原代培養(yǎng)不僅是建立各種細胞系的開始，也是從事組織或細胞培養(yǎng)工作人員應熟悉和掌握的基本的技術。原代培養(yǎng)的組織或者細胞的生物學特性沒有發(fā)生很大變化，仍具有二倍體遺傳物質(zhì)，接近和反映體內(nèi)生長特性，很適合作藥物測試、基因表達測試、細胞分化等實驗研究。
       原代培養(yǎng)是獲取細胞的主要手段，但原代培養(yǎng)的組織由多種成分組成，比較復雜，即使同一類型細胞如成纖維樣細胞或上皮樣細胞，細胞間也存在很大差異。如果供體不同，即使組織類型、部位相同，個體差別也可以在細胞上反映出來。因而原代細胞的部分生物學特征尚不穩(wěn)定，如要做較為嚴格的對比性實驗研究，還需要對原代培養(yǎng)的細胞進行短期傳代后再進行(需要注意的是有些細胞在傳代后可能會發(fā)生一些生物學特性的變化)。一般采用2-5代的細胞進行實驗。當然特殊情況和一些終端分化細胞如神經(jīng)細胞、巨噬細胞、心肌細胞除外。
       原代培養(yǎng)的方法很多，基本和常用的為組織塊原代培養(yǎng)法和離散細胞原代培養(yǎng)法(消化法)。
組織塊原代培養(yǎng)：
組織塊原代培養(yǎng)法是原代細胞培養(yǎng)常用的基本方法，適用于各種組織的原代培養(yǎng)，特別是難以消化的組織，組織塊原代培養(yǎng)法操作程序簡單，培養(yǎng)前不經(jīng)過酶液處理，細胞損傷較小。但由于培養(yǎng)過程中細胞移動受到較大限制，完成原代培養(yǎng)所需的時間較長。
組織塊培養(yǎng)的程序一般為：
       1.組織塊修整：將組織塊用平衡緩沖液反復沖洗，然后在滅菌的培養(yǎng)皿中剪碎至碎塊的直徑小于1mm²。
       2.貼壁：將組織塊間隔(小塊之間的間隔為1cm)放在培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基需要浸沒組織塊底部但不能使組織塊浮起。
       3.培養(yǎng)：通過生長繁殖，細胞可以從組織塊邊緣向四周游出，終生長繁殖連成片，原組織塊可以*消失。
離散細胞原代培養(yǎng)：
       動物細胞在體內(nèi)有嚴密的組織結(jié)構(gòu)，多數(shù)組織的形態(tài)是固體結(jié)構(gòu)，細胞與細胞或者細胞與細胞間質(zhì)之間聯(lián)系緊密，要得到大量的離散細胞就必須進行人工分離(消化培養(yǎng))。也有部分組織的細胞自然狀態(tài)下就是松散的，從體內(nèi)取出后不用處理(如血細胞)或稍加處理(如脾細胞)就可以得到細胞懸液。細胞離散后由于每個細胞都能與支持物接觸，營養(yǎng)供應均勻，因此適應快、增殖快、建系快。
通常的離散細胞原代培養(yǎng)步驟為：取材、剪切、消化、接種。
       原代培養(yǎng)的細胞往往在制備時含有很多細胞種類，這就需要對分離的細胞進行純化，細胞純化分為懸浮細胞純化和貼壁細胞純化。
懸浮細胞純化多使用密度梯度離心法和表面抗原法(需要固化的抗體，如各種細胞分離柱)。
貼壁細胞純化通常是細胞貼壁法(依據(jù)貼壁的快慢)和酶消化法(依據(jù)貼壁的細胞對消化酶的敏感程度不同)
       肝臟是由肝細胞組成，肝細胞極小，肉眼看不到，必須通過顯微鏡才能看到。人肝約有25億個肝細胞，50個肝細胞組成一個肝小葉，因此人肝的肝小葉總數(shù)約有50萬個。肝細胞為多角形，直徑約為20微米，有6-8個面，不同的生理條件下大小有差異，如饑餓時肝細胞體積變大。每個肝細胞表面可分為竇狀隙面、肝細胞面和膽小管面三種。肝細胞里面含有許許多多復雜的細微結(jié)構(gòu)：如肝細胞核、肝細胞質(zhì)、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體、高爾基氏體、微粒體及飲液泡等組成。
       肝細胞具有多種功能且代謝旺盛，離體培養(yǎng)的大鼠肝細胞用于毒理學、藥理學、生物化學及致癌作用等研究有許多優(yōu)點。醫(yī)學上常培養(yǎng)肝細胞作為理想的體外模型，在肝病研究、護肝藥物的研發(fā)等諸多方面發(fā)揮著日益重要的作用。但肝細胞在體外增殖能力差，原代培養(yǎng)難以成功，故在一定程度上限制了肝細胞培養(yǎng)的廣泛開展。制備離體肝細胞常用的方法有非酶分離細胞法、離體肝臟酶消化分離法以及在體肝臟酶灌注法。
實驗步驟：
       1.在玻璃培養(yǎng)皿中裝滿冰后倒置成冰臺，同時取3個60mm培養(yǎng)皿，加入2毫升預冷的PBS， 標記上1、2、3(1號和2號培養(yǎng)皿需要放在冰臺上使用) 。
       2.將麻醉過的小鼠平放在解剖臺上，用乙醇擦洗其胸部及腹部。在小鼠的肋骨下沿胸骨方向剪一口，摘除小鼠的肝臟并轉(zhuǎn)移到1號培養(yǎng)血中(注意一定不要弄破內(nèi)臟，以免帶來嚴重污染，解剖工具必須泡在75%乙醇中，用過即洗)，剔除心臟上的結(jié)締組織和血塊后轉(zhuǎn)入2號培養(yǎng)皿。
       3.*清洗肝臟后轉(zhuǎn)入3號培養(yǎng)m(用注射器沖洗肝臟內(nèi)部至肝臟呈灰白色)

4.用解剖剪把肝臟切碎成1mm?大小后把含有組織塊的溶液轉(zhuǎn)入15毫升離心管。5.靜置靜置待組織沉淀后棄上清，加入5毫升胰蛋白酶，37℃孵育5分鐘后加入兒滴胎牛血清終止消化。

       6.用注射器的橡膠頭輕輕研磨組織塊成糊狀，把含有組織的溶液用200目的尼龍篩網(wǎng)過濾到新的離心管中。
       7.1000轉(zhuǎn)離心5分鐘， 緩慢吸去上清， 用DMEM重懸后， 1000轉(zhuǎn)離心5分鐘， 盡量消除殘留的胰酶(操作在細胞間的超凈工作臺中進行)。
       8.加入含20%胎牛血清的*培養(yǎng)基重懸沉淀后，把肝細胞鋪到培養(yǎng)皿中，于二氧化碳培養(yǎng)箱37℃、5%COz條件下培養(yǎng)， 24小時換液， 以后每2天換液(操作在細胞間的超凈工作臺中進行)
       肝細胞接種培養(yǎng)4小時即可看到有部分細胞貼壁，24小時后細胞已基本貼壁，這時可以換液除去血細胞，3天左右培養(yǎng)瓶中出現(xiàn)成群的新生細胞集落并向周圍生長。
       肝細胞剛接種時有兩種形狀：一種體積較小胞漿顆粒較多；一種體積較大胞漿透明。兩種細胞均為圓形或橢圓形，培養(yǎng)5天時，細胞貼壁牢固，體積明顯增大，仲展生長成上皮樣并相互連接融合成片。一般為了幫助細胞貼附可以在培養(yǎng)器皿上先涂上一層膠原或者一些促貼附成份(如Matrix等)