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    在傳統(tǒng)的軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)中，細(xì)胞生長(zhǎng)在上層含有細(xì)胞培養(yǎng)基的軟瓊脂中，下層軟瓊脂也與細(xì)胞培養(yǎng)基混合，但含有較高濃度的瓊脂。這可以防止細(xì)胞貼附在培養(yǎng)板上，還可以使轉(zhuǎn)化細(xì)胞形成可見(jiàn)的菌落。這種技術(shù)的原理是正常細(xì)胞依靠細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的接觸才能生長(zhǎng)和分裂，相反，不管周圍環(huán)境如何，轉(zhuǎn)化細(xì)胞均具有生長(zhǎng)和分化的能力，因此能夠以錨定獨(dú)立的方式形成菌落的細(xì)胞被認(rèn)為是轉(zhuǎn)化和致癌的。

        實(shí)驗(yàn)操作：

    準(zhǔn)備材料和試劑：

    1、配制2×培養(yǎng)基：1 g培養(yǎng)基粉末，0.2 g碳酸氫鈉，加入去離子水，定容到50 mL。

    2、將培養(yǎng)基經(jīng)0.2 μm濾膜過(guò)濾除菌。

    3、加入目標(biāo)細(xì)胞所需培養(yǎng)基的其他成分。例如：用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)CMT 167細(xì)胞需要加入10% FBS，1% 青霉素/鏈霉素。使用之前將培養(yǎng)基放在37°C恒溫水浴鍋中。

    4、配制1×培養(yǎng)基，依照目標(biāo)細(xì)胞生長(zhǎng)所需培養(yǎng)基配制。

    5、配制1%瓊脂：1 g瓊脂加入到100 mL去離子水中。

    6、配制0.6%瓊脂：0.6 g瓊脂加入到100 mL去離子水中。

    7、將配好的瓊脂經(jīng)高溫高壓滅菌，滅菌后可放在4°C保存，使用前加熱至*溶解。

    8、配制氯化硝基四氮唑藍(lán)試劑：1 mg/mL氯化硝基四氮唑藍(lán)加入到1×PBS中。

        鋪下膠：

    1、將熔化的1%瓊脂溶液和預(yù)熱的2×培養(yǎng)基放入裝滿熱水（42°C）的桶（或恒溫水浴鍋）中，在熱水里放一個(gè)50 mL的錐形管。將桶放入超凈臺(tái)內(nèi)。

    2、6孔板中的每個(gè)孔需要加入1.5 mL混合的瓊脂和培養(yǎng)基，為保證足夠的量，一個(gè)6孔板準(zhǔn)備12 mL。

    3、首先加入6 mL的培養(yǎng)液到50 mL的錐形管，再加入6 mL的1%瓊脂溶液。將錐形管多次翻轉(zhuǎn)混勻，每個(gè)孔中迅速加入1.5 mL混合液，加混合液時(shí)不能產(chǎn)生氣泡。

    4、室溫靜置30 min，待下膠凝固。

        鋪上膠：

    1、收獲的細(xì)胞用胰蛋白酶消化，用培養(yǎng)基以1:5的比例稀釋（如1 mL胰蛋白酶，加4 mL培養(yǎng)基），放入15 mL錐形管。

    2、細(xì)胞計(jì)數(shù)：以每孔5000個(gè)細(xì)胞作為起始，并根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整。

    3、細(xì)胞懸浮液的體積需要1.5 mL。一個(gè)6孔板準(zhǔn)備12 mL細(xì)胞懸液。

    4、將熔化的0.6%瓊脂溶液放入裝有熱水（42°C）的桶中，在熱水里放一個(gè)50 mL的錐形管。將桶放入超凈臺(tái)內(nèi)。

    5、以1:1的比例混合0.6%瓊脂溶液和細(xì)胞懸液，吸取6 mL細(xì)胞懸浮液到50 mL錐形管，再加入6 mL的0.6%瓊脂溶液?；靹蚝笱杆偌尤?孔板中，每孔1.5 ml。小心避免產(chǎn)生氣泡。

    6、室溫靜置30 min，待上膠凝固后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱。

    7、足夠的菌落形成所需的時(shí)間因每個(gè)細(xì)胞系而異，通常為21天左右。每星期加兩次100 g的培養(yǎng)基以防止干燥。