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　　雜交瘤克隆化一般是指將抗體陽性孔進(jìn)行克隆化。因為經(jīng)過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內(nèi)只有一個克隆。在實際工作中，可能會有數(shù)個甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞、所需要的抗體（特異性抗體）分泌細(xì)胞和其它無關(guān)抗體的分泌細(xì)胞。要想將這些細(xì)胞彼此分開就需要克隆化。克隆化的原則是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆盡早進(jìn)行克隆化，否則抗體分泌的細(xì)胞會被抗體非分泌的細(xì)胞所抑制，因為抗體非分泌細(xì)胞的生長速度比抗體分泌的細(xì)胞生長速度快，二者競爭的結(jié)果會使抗體分泌的細(xì)胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細(xì)胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細(xì)胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。

　　克隆化的方法很多，常用的是有限稀釋法和軟瓊脂平板法。

　　1．有限稀釋法克隆

　?。?）克隆前1天制備飼養(yǎng)細(xì)胞層（同細(xì)胞融合）。

　　2）將要克隆的雜交瘤細(xì)胞從培養(yǎng)孔內(nèi)輕輕吹干，計數(shù)。

　?。?）調(diào)整細(xì)胞為3～10個細(xì)胞/ml。

　?。?）取頭天準(zhǔn)備的飼養(yǎng)細(xì)胞層的細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入稀釋細(xì)胞100μl。孵育于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中 。

　　（5）在第7天換液，以后每2～3天換液1次。

　　（6）8～9天可見 細(xì)胞克隆形成，及時檢測抗體活性。

　?。?）將陽性孔的細(xì)胞移至24孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)。

　?。?）每個克隆應(yīng)盡快凍存。

　　2．軟瓊脂培養(yǎng)法克隆

　　（1）軟瓊脂的配制：含有20%NCS（小牛血清）的2倍濃縮的RPMI1640。

　　①1%瓊脂水溶液：高壓滅菌，42℃預(yù)熱。

　?、?.5%瓊脂：由1份1%瓊脂加1份含20%小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42℃保溫。

　?。?）用上述0.5%瓊脂液（含有飼養(yǎng)細(xì)胞）15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。

　?。?）按100/ml，500/ml或5000/ml等濃度配制需克隆的細(xì)胞懸液。

　?。?）1ml 0.5%瓊脂液（42℃預(yù)熱）在室溫中分別與1ml不同濃度的細(xì)胞懸液相混合。

　?。?）混勻后立傾注于瓊脂基底層上，在室溫中10min，使其凝固，孵育于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中。

　　（6）4～5天 后即可見針尖大小白色克隆，7～10天后，直接移種至含飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔中進(jìn)行培養(yǎng)。

　?。?）檢測抗體，擴(kuò)大培養(yǎng)，必要是地再克隆化。