1. 用PBS液漂洗蓋玻片的原代細(xì)胞3次,每次30s;
2. 在室溫中用3%甲醛/PBS固定20min;
3. 用PBS液再漂洗3次,每次1min,后用濾紙吸干多余的PBS液;
4. 投入冷丙酮中(-10—-20℃)7min;
5. 用PBS漂洗3次,每次1min,后用濾紙吸干多余的PBS液;
6. 向直徑6cm的干凈碟皿*滴一滴濃度為0.1—0.2mg/ml的一級(jí)抗微管蛋白抗體,令小蓋片細(xì)胞面向下扣在抗體液上,覆以皿蓋,于37℃生化培養(yǎng)箱中放置45min—1h;
7. 向碟皿內(nèi)勻速緩慢滴加PBS,令蓋片浮起在液面,用鑷子夾出,按步驟3處理;
8. 向干凈碟皿*滴一滴濃度為0.1—0.2mg/ml的熒光標(biāo)記的二抗,其后操作按步驟6進(jìn)行;
9. 按步驟7和3操作;
10. 滴pH8.5的90%的甘油/PBS少許于載玻片上,把小蓋片的原代細(xì)胞面覆在大蓋片上;
11. 將蓋片置于熒光顯微鏡下觀察;
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