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免疫印跡法中蛋白樣品制備

閱讀：1389 發(fā)布時(shí)間：2019-7-9

　　1.單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提取

　　(1)倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液(或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫?huì)兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走)。

　　(2)每瓶細(xì)胞加3 ml 4℃預(yù)冷的PBS(0.01M pH7.2～7.3)。在恒溫?fù)u床平放輕輕搖動(dòng)1 min洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。

　　(3)按1ml裂解液加10 μl PMSF(100 mM)，搖勻置于冰上。(PMSF要搖勻至無(wú)結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合。)

　　(4)每瓶細(xì)胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來(lái)回?fù)u動(dòng)。

　　(5)裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)(動(dòng)作要快)，然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5 ml離心管中。(整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行。)

　　(6)于4℃下12000 rpm離心5 min。(提前開(kāi)離心機(jī)預(yù)冷)

　　(7)將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5 ml的離心管中放于-20℃保存。

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