養(yǎng)細胞是一件戳心戳肺的事。你要像照顧小孩一樣仔細對待，愛護她，呵護她。如果你照顧的時候能注意這些問題，會讓你的細胞養(yǎng)的更好。下面就將養(yǎng)細胞的注意事項跟大家交流一下。
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冷凍管應(yīng)如何解凍？
取出冷凍管后，須立即放入 37 ℃ 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內(nèi)全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預(yù)防冷凍管的爆裂。
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細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時，是否應(yīng)馬上去除 DMSO？
除少數(shù)特別注明對 DMSO 敏感的細胞外，絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞)，在解凍之后，應(yīng)直接放入含有 10~15 ml 新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除 DMSO 即可，如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附的問題。
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可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基？
不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應(yīng)的細胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基，細胞大都無法立即適應(yīng)，造成細胞無法存活。
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可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的血清種類？
不能。血清是細胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質(zhì)對于細胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。
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何謂 FBS，F(xiàn)CS，CS，HS？
FBS (fetal bovine serum) 和 FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，兩者都是指胎牛血清， FCS 是錯誤的使用字眼，請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。
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培養(yǎng)細胞時應(yīng)使用 5% 或 10% CO2？或根本沒有影響？
一般培養(yǎng)基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+ 作為 pH 的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中 NaHCO3 的含量將決定細胞培養(yǎng)時應(yīng)使用的 CO2 濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中 NaHCO3 含量為每公升 3.7 g 時，細胞培養(yǎng)時應(yīng)使用 10% CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中 NaHCO3 為每公升 1.5 g 時，則應(yīng)使用 5% CO2 培養(yǎng)細胞。
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何時須更換培養(yǎng)基？培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？
視細胞生長密度而定，或遵照細胞株基本數(shù)據(jù)上的更換時間，按時更換培養(yǎng)基即可。
除于特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。
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附著性細胞繼代時所使用的 trypsin-EDTA 濃度？應(yīng)如何處理？
一般使用的 trypsin-EDTA 濃度為 0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于 –20 ℃，避免反復(fù)冷凍解凍造成 trypsin 的活性降低，并可減少污染的機會。
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懸浮性細胞應(yīng)如何繼代處理？
一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中，稀釋細胞濃度即可，若培養(yǎng)液太多時，可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高，直到無法容納為止。分瓶時取出一部分含細胞的培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度，重復(fù)前述步驟即可。
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欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？
欲回收動物細胞，其離心速率一般為 1 000 rpm，5~10 分鐘，過高的轉(zhuǎn)速，將造成細胞死亡。
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細胞的接種密度為何？
依照細胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長的重要原因之一。
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細胞冷凍培養(yǎng)基的成分為何？
動物細胞冷凍保存時常使用的冷凍培養(yǎng)基是含 5~10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和 90~95 % 原來細胞生長用的新鮮培養(yǎng)基均勻混合。注意：由于 DMSO 稀釋時會放出大量熱能，故不可將 DMSO 直接加入細胞液中，必須使用前先行配制完成。
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DMSO 的等級和無菌過濾的方式為何？
冷凍保存使用的 DMSO 等級，必須為 Tissue culture grade 的 DMSO (如 Sigma D2650)，其本身即為無菌狀況，次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于 4 ℃，避免反復(fù)冷凍解凍造成 DMSO 的裂解而釋出有害物質(zhì)，并可減少污染的機會。若要過濾 DMSO，則須使用耐 DMSO 的 Nylon 材質(zhì)濾膜。
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冷凍保存細胞的方法？欲冷凍保存時，細胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細胞濃度？
冷凍保存方法一：冷凍管置于 4 ℃ 30~60 分鐘 →(-20 ℃ 30 分鐘) → -80 ℃ 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽 vapor phase 長期儲存。
冷凍保存方法二： 冷凍管置于已設(shè)定程序的可程序降溫機中每分鐘降 1~3 ℃ 至 –80 ℃ 以下， 再放入液氮槽 vapor phase 長期儲存。–20 ℃ 不可超過 1 小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入 –80 ℃ 冰箱中，存活率稍微降低一些。
冷凍管內(nèi)細胞數(shù)目一般為 1x106 cells/ml vial，融合瘤細胞則以 5x106 cells/ml vial 為宜。
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如何避免細胞污染？發(fā)生微生物污染時應(yīng)如何處理？
細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因為無菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染的血清和污染的細胞等。嚴格無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好的細胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染的方法。
如果細胞發(fā)生微生物污染，加入相應(yīng)抗生素，直接滅菌后丟棄。
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支原體 （mycoplasma）污染的細胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？對細胞培養(yǎng)有何影響？
不能以肉眼觀察出異狀。除極有經(jīng)驗的專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細胞株，無法以其外觀分辨。
支原體污染幾乎可影響所有細胞的生長參數(shù)，代謝及研究任一數(shù)據(jù)。故進行實驗前，必須確認細胞為 mycoplasma-free，實驗結(jié)果的數(shù)據(jù)方有意義。
偵測出細胞株有支原體污染時，應(yīng)直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細胞株。
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為何培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中，顏色會偏暗紅色，且 pH 值會越來越偏堿性？
培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)的 CO2 會逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性，而培養(yǎng)基中的酸堿指示劑 (通常為 phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿的結(jié)果， 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時，可以通入無菌過濾 CO2，以調(diào)整 pH 值。
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各種細胞培養(yǎng)用的 dish，flask 是否均相同？
不同廠牌的 dish 或 flask，其所 coating 的 polymer 不同，制造程序亦不同，雖對大部分細胞沒有太大的影響，唯有少數(shù)細胞則可能因使用廠牌不同， dish 或 flask 有生長差異。
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購買的細胞死亡或存活率不佳可能原因？細胞冷凍管解凍后，為何會有細胞數(shù)目太少的情形？
研究人員在細胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳；血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳；解凍過程錯誤；冷凍細胞解凍后，加以洗滌細胞和離心；懸浮細胞誤認為死細胞；培養(yǎng)溫度使用錯誤；細胞置于 –80 ℃ 太久。
研究人員在冷凍細胞培養(yǎng)時出現(xiàn)細胞數(shù)目太少，大都是因為離心過程操作上的失誤，造成細胞的物理性損傷，以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心，應(yīng)待細胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。
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收到的冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落的原因？
冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當(dāng)，造成冷凍管裂損，建議使用*小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫，是因熱脹冷縮的物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊。
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如何選用特殊細胞系培養(yǎng)基？
培養(yǎng)某一類型細胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在 MEM 中培養(yǎng)的細胞，很可能在 DMEM 或 M199 中同樣很容易生長?？傊?，首xuan MEM 做粘附細胞培養(yǎng)，RPMI-1640 做懸浮細胞培養(yǎng)是一個好的開始，各種目的無血清培養(yǎng)首xuan AIM V(12005)培養(yǎng)基(SFM)。
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L-*在細胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？
L-*在細胞培養(yǎng)時是重要的。脫掉氨基后，L-*可作為培養(yǎng)細胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-*在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有終定論。L-*的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。
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GlutaMAX-I 是什么？培養(yǎng)細胞如何利用 GlutaMAX-I？這個二肽有多穩(wěn)定？
GlutaMAX-I 二肽是一個 L-*的衍生物，其不穩(wěn)定的 alpha-氨基用 L-*來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放 L-*供利用。GlutaMAX-I 二肽非常穩(wěn)定，即使在 121 磅滅菌 20 分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有小的降解，如果在相同條件下，L-*幾乎*降解。
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什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？
酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為 PH 值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用(特別是雌激素)。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。
丙酮酸鈉可以作為細胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。
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為什么目錄上說 Hank's * （HBS） 在空氣中使用，不需要 CO2 培養(yǎng)箱？HBS 和 Earle's * （EBS） 有什么本質(zhì)的功能差別？
HBS 和 EBS 的主要差別在于*的水平，在 Eagles (2.2 g/L) 中比在 Hanks (0.35 g/L) 中高。*需用高水平的 CO2 平衡，以維持溶液的 PH 值。Eagles 液在空氣水平的 CO2 中，溶液會變堿，Hanks 液在 CO2 培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在 CO2 培養(yǎng)箱中保存組織，需要用 Eagles 液，如果僅僅是清洗將要在細胞培養(yǎng)基中儲存的組織，用 Hanks 液就可以了。
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二價離子抑制*活性嗎？使用*時加入 EDTA 的目的是什么？
二價離子的確抑制*活性。EDTA 用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制*的活性。建議*處理細胞前，用 EDTA 清洗細胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價離子。
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其他注意事項
當(dāng)在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的 50%。血清蛋白會結(jié)合和滅活一些抗生素。在無血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活，可能對于細胞達到毒性水平。
一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。
大部分添加物和試劑多可以凍融 3 次，如果次數(shù)更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會影響它的性能。
在溶解的一周內(nèi)使用貯存在 4℃ 冰箱中的液體*溶液。*在 4℃ 就可能開始降解，如果在室溫下放置超過 30 分鐘，就會變得不穩(wěn)定。
為了保持 CO2 培養(yǎng)箱水盤清潔，需定期 (至少每兩周一次) 用無菌蒸餾水或無菌去離子水更換。
