MTT通常用于藥物(也包括其他處理方式如放射線照射)對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞毒性的測(cè)定以及.細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性測(cè)定。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等。它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。但是由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測(cè)。這不僅使工作量增加，也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲瓚的有機(jī)溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)者也有損害。在MTT實(shí)驗(yàn)步驟中要注意的是MTT有致癌性，用的時(shí)候小心,有條件hao帶那種透明的薄膜手套.配成的MTT需要無菌，MTT對(duì)菌很敏感；往96孔板加時(shí)不避光也沒有關(guān)系，畢竟時(shí)間較短，或者你不放心的時(shí)候可以把操作臺(tái)上的照明燈關(guān)掉。
 

　　MTT實(shí)驗(yàn)步驟——貼壁細(xì)胞
 

　　1、收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至1000-10000孔，(邊緣孔用無菌PBS填充)。
 

　　2.、5%CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底(96孔平底板),加入濃度梯度的藥物,原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個(gè)梯度,每孔100ul,設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔.建議設(shè)5個(gè)，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況
 

　　3.、5%CO2，37℃孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。
 

　　4、每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。
 

　　5、終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。
 

　　6、每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速震蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值。
 

　　7、同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)，對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)
 

　　MTT實(shí)驗(yàn)步驟——懸浮細(xì)胞
 

　　1、收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度1×106/ml，按次序?qū)ⅱ傺a(bǔ)足的1640(無血清)培養(yǎng)基40ul ；②加Actinomycin D(有毒性)10ul用培養(yǎng)液稀釋 l?g/ml，需預(yù)試尋找jia稀釋度，1:10-1:20)；③需檢測(cè)物10ul；④細(xì)胞懸液50ul(即5×104cell/孔)，共100ul加入到96孔板(邊緣孔用無菌水填充)。每板設(shè)對(duì)照(加100?(儲(chǔ)存液100 1640)。
 

　　2、置37℃，5%CO2孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。
 

　　3、每孔加入10 ul MTT溶液(5 mg/ml，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。(懸浮細(xì)胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4 h后可跳過步驟4)，直接酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm(630nm校準(zhǔn))測(cè)量各孔的吸光值)
 

　　4、離心(1000轉(zhuǎn)x10min)，小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm(630nm校準(zhǔn))測(cè)量各孔的吸光值。
 

　　5、同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)，對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)，每組設(shè)定3復(fù)孔。
 

　　在MTT實(shí)驗(yàn)步驟中需要注意的是MTT法只能用來檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力，但不能測(cè)定細(xì)胞絕dui數(shù)。在用酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果的時(shí)候，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的線性，MTT 吸光度hao在0-0.7 范圍內(nèi)。配制MTT時(shí)用PBS溶解,也有人用生理鹽水配，60℃水浴助溶。