產(chǎn)品名稱:第1鏈cDNA合成試劑盒
 

　　英文名稱:RT EasyTM(For first-strand cDNA synthesis)
 

　　產(chǎn)品規(guī)格:25 rxns 100 rxns
 

　　產(chǎn)品貨號(hào):RT-01011
 

　　保存說(shuō)明:短期室溫，*2-8℃
 

　　產(chǎn)品描述:用于長(zhǎng)cDNA合成或者客戶特定引物RT反應(yīng)
 

　　英文名稱:RT EasyTM(First-strand cDNA for Real Time PCR)
 

　　產(chǎn)品規(guī)格:50 rxns 200 rxns
 

　　產(chǎn)品貨號(hào):RT-01021
 

　　產(chǎn)品描述:第1鏈合成，添加2種引物，用于Real Time PCR
 

　　第1鏈cDNA合成試劑盒注意事項(xiàng):
 

　　1、確保RNA完整性及純度。RNA質(zhì)量是決定合成cDNA第1鏈成功的關(guān)鍵因素,其純度及完整性可由OD260/OD280比值和進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。較純的RNA樣品OD260/OD280比值通常為1.8-2.0,若該比值偏低,應(yīng)進(jìn)一步純化。真核生物RNA樣品電泳圖譜28s和18s的比值約為2:1,否則,表明有RNA降解。
 

　　2、避免RNA酶污染。進(jìn)行cDNA合成所用的器皿、試劑和溶液必須*無(wú)菌。操作過(guò)程始終戴手套以杜絕各種RNA酶的污染。
 

　　3、 合成cDNA第1鏈的引物選擇。選擇oligo(dT)12-18作為反轉(zhuǎn)錄引物,可保證cDNA具有完整的3’-端,通?？傻玫浇咏L(zhǎng)的cDNA第1鏈;若選擇隨機(jī)寡核苷酸(dN)6或(dN)9作為引物,引物在整個(gè)mRNA的多個(gè)位點(diǎn)退火,產(chǎn)生短的部分長(zhǎng)度的cDNA第1鏈。這種方法經(jīng)常用于獲得5’末端序列及從帶有二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域或帶有逆轉(zhuǎn)錄酶不能復(fù)制的終止位點(diǎn)的RNA模板獲得cDNA。
 

　　第1鏈cDNA合成試劑盒操作方法:
 

　　1、 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
 

　　(1) 在無(wú)菌薄壁管中加入以下成份:
 

　　Total RNA   0.5-1.0µg
 

　　(dN)9 or oligo(dT)18  100pmol
 

　　(2) 混勻后,70℃變性5min,將薄壁管迅速置于冰上冷卻,然后依次加入以下成份:
 

　　5×M-MLV Buffer     4µl
 

　　dNTPs(10mM each)    1µl
 

　　RNasin        10U
 

　　100mM DTT       2µl
 

　　M-MLV Reverse Transcriptase  100U
 

　　DEPC-treated water    up to 20µl
 

　　(3) 混勻后短暫離心，使用oligo(dT)18引物時(shí)在42℃，使用隨機(jī)引物(dN)9時(shí)在37℃下溫育1小時(shí)。
 

　　(4) 94℃ 5min終止反應(yīng)后,冰上冷卻。
 

　　(5) 合成的cDNA第1鏈可直接用于PCR擴(kuò)增或進(jìn)行其它下游操作。