該試劑盒用于從克隆菌中大量提取去除內(nèi)毒素的高品質(zhì)質(zhì)粒，一般來說可從200ml過夜培養(yǎng)的菌液中提取高拷貝質(zhì)粒600-1200ug，低拷貝質(zhì)粒50-400ug。試劑盒自帶的說明書為英文說明書，不是非常方便閱讀，所以本文根據(jù)英文原版重新翻譯了一遍，希望對大家有幫助。
 

　　實驗前準備
 

　　1. 使用前,將RNase A全部加入Solution I中并于4度保存。
 

　　2. 按下表用無水乙醇稀釋DNA Wash Buffer，并于室溫保存。
 

　　試劑盒型號    加入的乙醇量(ml)
 

　　D6926-00B    60
 

　　D6926-01B    160
 

　　D6926-03B    200
 

　　D6926-04B    200每瓶
 

　　細菌的培養(yǎng)：
 

　　1. 在容積為1-4升的培養(yǎng)瓶中加入200ml含篩選抗生素的LB培養(yǎng)基，加入含目的質(zhì)粒的克隆菌(一般為1/1000比例接種，也即200ul)，然后置37℃振蕩培養(yǎng)12-16小時。為了獲得*的效果，*接菌使用經(jīng)過夜培養(yǎng)活化的菌種。對于大多數(shù)質(zhì)粒的提取，我們強烈*使用endA陰性的菌種，比如DH5α和JM109。
 

　　*的培養(yǎng)條件對于質(zhì)粒DNA的得率至關(guān)重要。*的培養(yǎng)條件包括，首先由新轉(zhuǎn)化或新劃線的培養(yǎng)板中挑取單個克隆，然后接種于2-5ml含合適篩選抗生素的培養(yǎng)基中，37℃振蕩(搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定在約300rpm為宜)培養(yǎng)約8小時；然后繼續(xù)接種于含抗生素的預(yù)熱的液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩(~300rpm)培養(yǎng)12-16小時。盛培養(yǎng)基的容器的容積需至少為培養(yǎng)基體積的3-4倍(注：保證培養(yǎng)環(huán)境中有足夠的氧氣，防止厭氧菌的繁殖)，初始培養(yǎng)基接種的稀釋比例為1/500到1/1000為宜。
 

　　為了獲得*的效果，我們*每次培養(yǎng)后測定OD600值。對于過夜培養(yǎng)活化的細菌而言，OD600的值處于1.5-2.0之間是細菌生長良好的指標。在測定OD600時，為了保證測量值處于光度計測量的線性范圍(0.1-0.5)，需將培養(yǎng)物進行必要的稀釋(10到20倍)。當接種進行大量培養(yǎng)時，我們*細菌的終密度在2.0-3.0之間為宜。當使用富營養(yǎng)的培養(yǎng)基，需要注意保證細菌的密度不要超過OD600為3.0；如果使用凍存的甘油菌，需要首*行劃線并挑取單克隆，然后和前面一樣進行必要的活化。
 

　　富營養(yǎng)培養(yǎng)基如2xYT或TB，不*使用本試劑盒。
 

　　堿性-SDS溶液裂解細菌：
 

　　2. 取100-200ml菌液3,500-5,000xg室溫離心10min收集菌體沉淀。
 

　　3. 小心去除上清液，為了保證所有上清去除*，可使用干凈的紙巾將容器壁上液滴吸除，加10ml Solution Ⅰ/RNase A , 渦旋或用移液槍上下吹打重懸菌體，重懸*對于獲得zui高的得率至關(guān)重要;
 

　　4. 加10ml SolutionⅡ，來回顛倒10-15次輕柔混勻，以得到澄清的裂解液。如有必要可室溫孵育2min。
 

　　避免混合時動作過于劇烈，過于劇烈會剪切細菌的染色體DNA(從而在接下來的步驟中不能被充分沉淀)并且導(dǎo)致質(zhì)粒的純度降低。(當Solution II在不使用時，需要將瓶蓋旋緊，防止空氣中的CO2與Solution II反應(yīng)生成碳酸鹽)
 

　　5. 加5ml Buffer N3，輕輕顛倒充分混勻幾次直至白色絮狀沉淀出現(xiàn)。室溫放置2—3min，期間偶爾顛倒混合，以使其充分反應(yīng)。
 

　　注意：該溶液必須充分混合。如果混合物依然非常的粘滯，呈褐色并且成團狀，則需要進一步混合以充分中和該溶液，充分中和對于獲得更好的得率至關(guān)重要。使用冰預(yù)冷的Buffer N3將有利于沉淀更多的細菌蛋白。
 

　　6. 準備結(jié)合柱：加5ml的Buffer GPS至結(jié)合柱中，室溫放置3—10min，3,000—5,000×g室溫離心5min，棄濾液(注：這里中文說明書中添加了一步“往柱子里加入10ml無菌水離心棄濾液”，而在英文原版中是沒有的)，把柱子插回50ml收集管中。(注：這里可以使用一個舊的50ml離心管收集廢液，而將試劑盒中附帶的新離心管用于zui后一步質(zhì)粒洗脫時使用)。
 

　　使用針筒式過濾器過濾裂解物：
 

　　7. 將第5步得到的裂解液及沉淀物全部轉(zhuǎn)移至針筒式過濾器中，準備一個干凈的50ml離心管收集濾液。將過濾器的活塞插回針筒。
 

　　8. 將針筒對準50ml收集管，輕輕推動活塞，收集澄清的濾液。一些裂解液中可能仍然殘留有絮狀沉淀物，不要強行將這些殘留的裂解液推擠過柱。
 

　　9. 加入等體積的ETR Binding Buffer(~25ml)到結(jié)合柱上，上下反復(fù)顛倒7-10次。
 

　　使用HiBind結(jié)合柱純化質(zhì)粒DNA(注：離心法，適用于同時抽提多個樣品，對于樣本量較少時，*使用后面的真空抽濾法)
 

　　10. 小心轉(zhuǎn)移裂解液至HiBind結(jié)合柱，3,000—5,000×g離心3—5min,使液體濾過柱子，棄濾液。
 

　　11. 重復(fù)步驟10，直至所有裂解液都過濾完，棄濾液。
 

　　12. 加入10ml ETR Wash Buffer到結(jié)合柱上，3,000—5,000×g離心3—5min,使全部液體濾過柱子，棄濾液。
 

　　13. 加入10ml Buffer EHB到結(jié)合柱上，3,000—5,000×g離心3—5min使全部液體濾過柱子，棄濾液。
 

　　14. 加入15ml DNA Wash Buffer(預(yù)先添加了乙醇)到結(jié)合柱上，3,000—5,000×g離心3—5min使全部液體濾過柱子，棄濾液；
 

　　注意：試劑盒附帶的DNA Wash Buffer在使用之前必須按標簽的提示用無水乙醇稀釋。如果試劑是低溫保存的，使用前需要預(yù)先恢復(fù)溫度至室溫。
 

　　15. 加入10ml DNA Wash Buffer到結(jié)合柱上3,000—5,000×g離心3—5min使全部液體濾過柱子，棄濾液；
 

　　16. 把空柱子套回離心管，zui大轉(zhuǎn)速(不超過6,000×g)離心10—15min使柱子充分干燥。不要跳過該步驟-該步對于去除柱子中殘留的乙醇非常關(guān)鍵。
 

　　使用HiBind結(jié)合柱純化質(zhì)粒DNA(注：真空抽濾法，對于樣品個數(shù)較少時，該方法比較節(jié)省時間)
 

　　10. 安裝好抽濾裝置，將結(jié)合柱與抽濾瓶密閉結(jié)合
 

　　11. 轉(zhuǎn)移裂解液至HiBind結(jié)合柱，使液體全部濾過柱子。
 

　　12. 加入10ml ETR Wash Buffer到結(jié)合柱上，洗滌一次(注：流速可能會比較慢)。
 

　　13. 加入10ml Buffer EHB到結(jié)合柱上，洗滌一次。
 

　　14. 加入15ml DNA Wash Buffer(預(yù)先添加了乙醇)到結(jié)合柱上，洗滌一次。
 

　　15. 再次加入10ml DNA Wash Buffer，洗滌一次。
 

　　16. 繼續(xù)抽真空10-15min，以充分干燥結(jié)合柱(注：當抽提多個樣品時，可以選擇離心法步驟16中的方法以節(jié)約時間)。
 

　　由結(jié)合柱洗脫質(zhì)粒DNA(常規(guī)方法，也可以使用后面介紹的另一種洗脫方法)
 

　　17. 進一步干燥柱子：選擇以下任一種方法在洗脫前進一步干燥結(jié)合柱
 

　　A. 將結(jié)合柱轉(zhuǎn)移真空抽濾裝置上室溫抽濾15min
 

　　B. 將結(jié)合柱放入65℃恒溫烤箱，烘烤10—15min
 

　　18. 把結(jié)合柱套在一個新的50ml離心管中(注：可以使用試劑盒附帶的離心管)，加入1—3ml(注：依據(jù)要求的質(zhì)粒終濃度，可以分步兩次洗脫，第1次少量洗脫保證得到高濃度的質(zhì)粒，第二次稍加大洗脫體積，保證盡可能將質(zhì)粒洗脫*) Endotoxin-Free Elution Buffer(或去離子水)至結(jié)合柱的膜上，室溫放置2—5min，以zui高轉(zhuǎn)速離心(不超過6,000xg)5min洗脫質(zhì)粒DNA。
 

　　上面描述的方法可以回收大約60-80%柱結(jié)合的DNA。也可以選擇進行二次洗脫從而將所有殘留的DNA全部回收，但二次洗脫的DNA濃度會低一些。另外，第二次洗脫也可以使用*洗脫下來的液體以保證得到較高濃度的質(zhì)粒DNA。將洗脫液或去離子水預(yù)熱至70℃并且在洗脫前，室溫放置2min，可能會顯著提升zui終的得率。
 

　　注意：使用該方法得到的質(zhì)?？梢院芎玫膽?yīng)用與PCR，限制性酶切，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等。預(yù)期的質(zhì)粒濃度可能依據(jù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)不同存在一些出入。但是，一般來說高拷貝的質(zhì)粒終濃度在150-600ug/ml。該方法得到的質(zhì)?？赡軙恍┮掖細埩?，但一般不會影響下游實驗。如果需要獲得更高的質(zhì)粒濃度和*去除乙醇殘留，可以選擇使用下面的方法。
 

　　另一種結(jié)合柱洗脫質(zhì)粒DNA的方法
 

　　1. 把結(jié)合柱套在一個新的50ml離心管中(注：可以使用試劑盒附帶的離心管)，加入6ml Endotoxin-Free Elution Buffer(或去離子水)至結(jié)合柱的膜上，室溫放置2min，以zui高轉(zhuǎn)速離心(不超過6,000xg)5min以洗脫質(zhì)粒DNA。將洗脫液或去離子水預(yù)熱至70℃并且在洗脫前，室溫放置2min，可能會顯著提升zui終的得率。
 

　　2. 將洗脫的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移到一個干凈的適用于沉淀的離心管中。加入260ul 5M NaCl以及4.4ml室溫放置的異丙醇。渦旋以充分混勻，然后以不低于15,000×g轉(zhuǎn)速4℃離心30min。小心地去除上清。
 

　　3. 用2ml 70%的乙醇洗滌沉淀一次，以不低于15,000×g轉(zhuǎn)速4℃離心10min，小心地去除上清。空氣干燥沉淀5-10min。
 

　　4. 加入200-500ul(依據(jù)要求的質(zhì)粒終濃度)Endotoxin-Free Eluiton Buffer或去離子水重懸DNA。