ELISA是一個間接的檢測過程，這在很多文獻(xiàn)資料上都有這樣的記載。但是很少有研究資料詳細(xì)的描述間接測量的信號傳遞過程，以及傳遞過程中出現(xiàn)的偏差。這里小編從宏觀和微觀兩個角度對ELISA進(jìn)行系統(tǒng)分析，該分析有助于搭建穩(wěn)定的ELISA平臺，并正確地使用和評估不同性質(zhì)的酶聯(lián)抗體和顯色液等通用材料。

宏觀上來講，ELISA檢測的函數(shù)曲線在實(shí)際操作過程中描述的是劑量濃度的抗體和信號之間的相關(guān)關(guān)系，而其實(shí)質(zhì)是為了描述劑量濃度的抗體和對應(yīng)抗原-抗體偶聯(lián)物之間的相關(guān)關(guān)系?？乖?抗體偶聯(lián)物經(jīng)過了酶聯(lián)抗體反應(yīng)和酶催化放大反應(yīng)，催化產(chǎn)物檢測后轉(zhuǎn)換成信號。該信號間接的代表了抗原-抗體偶聯(lián)物。這種間接的轉(zhuǎn)化過程經(jīng)歷了三重信號的傳遞過程，而只有在三重傳遞保證線性的情況，抗體濃度-信號劑量曲線才能等同于抗體濃度-抗體抗原偶聯(lián)物濃度劑量曲線，如果進(jìn)行了非線性傳遞將會影響到整個檢測方法的真實(shí)性和準(zhǔn)確性，下面小編將從微觀角度簡單介紹下信號傳遞過程中可能存在的偏差。

1.信號檢測偏差：酶催化產(chǎn)物轉(zhuǎn)換成信號時有可能會產(chǎn)生的偏差，這個偏差在一些文獻(xiàn)中也稱之為儀器的非線性檢測區(qū)域，即當(dāng)酶催化產(chǎn)物濃度過高時，催化產(chǎn)物濃度和信號值之間不*呈線性關(guān)系，這個現(xiàn)象是普遍存在的，如圖3所示某品牌酶標(biāo)儀的參數(shù)性能，注意該儀器的測量范圍是0-4 OD，而該儀器確保的檢測線性范圍是0-3 OD。一般來講在進(jìn)行吸光度法讀數(shù)時，檢測的信號值gao值控制在3左右。如果兩個相鄰的抗體濃度點(diǎn)對應(yīng)的信號值在OD值3.5及以上時都會特別接近，這兩個信號值很有可能是有信號傳遞偏差的。這個可以通過高濃度的酶催化產(chǎn)物梯度稀釋查看信號的線性范圍確認(rèn)。

2.酶催化反應(yīng)傳遞偏差：該偏差是由酶催化顯色液引起的，其實(shí)質(zhì)是酶聯(lián)抗體的濃度和其對應(yīng)催化產(chǎn)物的濃度是否線性相關(guān)。如圖4所示由于酶催化反應(yīng)在未終止前是一個持續(xù)反應(yīng)的信號放大過程，信號的產(chǎn)生是時間的累積量，在反應(yīng)過程中酶活可能會喪失（左），顯色液的有效成分在不斷的減少時，梯度濃度的酶催化反應(yīng)在反應(yīng)時間內(nèi)的可能不會是勻速反應(yīng)狀態(tài)（右）。

這個可以通過動力學(xué)讀數(shù)進(jìn)行確認(rèn)。目前市面上有多種顯色液可供選擇，顯色能力強(qiáng)和弱的產(chǎn)品信號差異可能達(dá)到20-50倍，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的正確的選擇顯色液并確認(rèn)酶催化過程的線性傳遞。

3.酶聯(lián)抗體反應(yīng)傳遞偏差，即酶聯(lián)抗體和抗體抗原偶聯(lián)物反應(yīng)后，酶聯(lián)抗體-抗原抗體偶聯(lián)物的濃度能否線性的代表抗體抗原偶聯(lián)物的濃度。這個比較復(fù)雜的過程，主要是因?yàn)槊嘎?lián)抗體的異質(zhì)性導(dǎo)致的，酶聯(lián)抗體多為多抗，該抗體偶聯(lián)上的HRP分子數(shù)目也存在差異，很難用單一的實(shí)驗(yàn)去論證這個線性過程。但值得注意的是，酶聯(lián)抗體加入反應(yīng)濃度應(yīng)該遠(yuǎn)大于抗體抗原偶聯(lián)物的濃度，這樣能夠保證基本所有的抗體抗原偶聯(lián)物都被轉(zhuǎn)換成酶聯(lián)抗體-抗原抗體偶聯(lián)物，酶聯(lián)濃度加入過少會導(dǎo)致劑量曲線的高濃度點(diǎn)出現(xiàn)假平臺期，影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；酶聯(lián)濃度過高可能會導(dǎo)致非特異信號的增加，還有酶聯(lián)濃度的增加會導(dǎo)致信號的增加，可能會導(dǎo)致信號值超過線性檢測范圍。所以酶聯(lián)濃度的反應(yīng)濃度是一個值得選擇的參數(shù)。