染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation，ChIP）是一種用于研究目的蛋白在染色質(zhì)上定位的技術。ChIP 的原理是通過甲醛處理細胞固定 DNA 和蛋白，然后提取染色質(zhì)，使用超聲或酶解將染色質(zhì)剪切成小片段。

之后使用結(jié)合在染色質(zhì)的目的蛋白或組蛋白修飾特異性抗體富集 DNA 片段。富集的 DNA 片段可以通過 PCR，DNA 芯片或測序進行分析。雖然原理看起來很簡單，但 ChIP 是一項非常具有挑戰(zhàn)的技術，很多因素都可能導致實驗失敗。

如何選擇 ChIP 抗體？

抗體的質(zhì)量是 ChIP 成功非常關鍵的因素，只有能夠識別染色質(zhì)狀態(tài)下的天然蛋白構象的高質(zhì)量的抗體才能用于 ChIP 實驗。

想要知道一個抗體是否適合用于 ChIP 實驗其實很簡單。正規(guī)廠家的說明書都會有一項是說明應用范圍的。挑選抗體時優(yōu)先選擇應用范圍有「ChIP」并有相關數(shù)據(jù)的，說明抗體經(jīng)過檢測，可以用于 ChIP。如果找不到這樣的抗體可以優(yōu)先挑選經(jīng)過 IF、IP、ICC 驗證的，之后自己進行驗證或委托外包服務公司進行驗證。

除此之外，在做組蛋白修飾 ChIP 時，因為各種組蛋白修飾之間差異非常小，這對抗體特異性提出了更高的要求。如果抗體特異性不夠高導致發(fā)生交叉反應，很可能產(chǎn)生假陽性或假陰性結(jié)果。針對這一問題，可以使用包括 384 種不同修飾的組蛋白芯片檢測自己生產(chǎn)組蛋白抗體特異性，保證組蛋白抗體的高特異性。

沒有特異性抗體怎么辦？

如果目標蛋白沒有商業(yè)化的抗體可選，一種方式是定制抗體，之后進行 ChIP 驗證。這種方式的優(yōu)點是檢測到的是內(nèi)源性的蛋白，結(jié)果反映的一定是體內(nèi)真實的蛋白和 DNA 相互作用。但定制抗體成本較高，并且 ChIP 驗證過程失敗率高達 75%。

另一種方式是給目標蛋白加標簽，通過標簽檢測目標蛋白。AM-Tag 標簽是專門針對 ChIP 設計的蛋白標簽。通過質(zhì)粒構建加到目標蛋白 C 端。轉(zhuǎn)染進入細胞之后通過特異性 AM-tag 抗體進行 ChIP。Active Motif 實驗室通過構建雌激素受體（ER）加 AM-tag 標簽質(zhì)粒檢測 AM-tag ChIP 效果，結(jié)果數(shù)據(jù)與發(fā)表文章中使用 ER 抗體檢測內(nèi)源性蛋白結(jié)果一致。

沒有足夠的起始樣本怎么辦？

ChIP 是一項富集技術，不是純化方法。大部分我們感興趣的蛋白或組蛋白修飾分布在整個基因組，只是不同區(qū)域的富集度不同。因此，有意義的結(jié)果需要的富集。

傳統(tǒng)的 ChIP 實驗需要至少兩百萬細胞作為起始材料，這對于有些珍貴細胞樣本是非常困難的。解決這個問題的關鍵是通過 ChIP 的 buffer 及條件優(yōu)化，降低非特異性的背景，實現(xiàn)*的信噪比。

針對這個問題，一方面通過 buffer 條件優(yōu)化，提供高靈敏 ChIP 試劑盒，zui少可用 1000 個細胞進行 ChIP 實驗。另一方面，也提供低細胞量的 ChIP-Seq 服務，對于高豐度目標蛋白（如組蛋白修飾）僅需 10000 個細胞；對于低豐度目標蛋白（如轉(zhuǎn)錄因子），僅需 50000～500000 個細胞。

如何對 ChIP-seq 進行jing確定量？

我們的研究團隊在對不同樣本的 H3K27me3 ChIP-seq 數(shù)據(jù)比較時，發(fā)現(xiàn)了一個有意思的問題。通過 H3K27me3 甲基轉(zhuǎn)移酶 EZH2 的抑制劑處理細胞以后，免疫印跡檢測結(jié)果表明，H3K27me3 整體水平顯著下降。ChIP-qPCR 也檢測到很多位點的 H3K27me3 水平有明顯下調(diào)。

但用常規(guī)的 ChIP-seq 分析方法比較，并不能檢測到 H3K27me3 水平的下降。造成這個結(jié)果的原因在于在標準的 ChIP-seq 實驗過程中，文庫構建需要的 PCR 擴增以及常規(guī)數(shù)據(jù)分析時對整體數(shù)據(jù)量的校正掩蓋了樣本間數(shù)據(jù)量的差異。

針對這一問題，Active Motif 憑借多年的 ChIP-seq 服務經(jīng)驗成功研發(fā)出「Spike-In」校正策略。標準的 ChIP 反應是使用樣本染色質(zhì)和抗體建立的。在「Spike-in」校正體系中，果蠅（Dropsophila）「Spike-in」染色質(zhì)和識別果蠅染色質(zhì)的抗體也被加入到反應體系中。因為果蠅的基因組和人的基因組同源性很低，在做測序分析的時候，它就可以作為內(nèi)參，對整個 ChIP-seq 起到矯正作用。

如何檢測染色質(zhì)上蛋白之間的相互作用？

RIME（Rapid Immunoprecipitation Mass spectrometry of Endogenous proteins）是一項 ChIP 和質(zhì)譜分析相結(jié)合的技術。非常適合用于鑒定轉(zhuǎn)錄輔助因子和染色質(zhì)相關蛋白的相互作用。傳統(tǒng)的鑒定蛋白相互作用的方法是 IP 之后進行質(zhì)譜分析。與 IP 方法不同，RIME 使用的起始材料經(jīng)過交聯(lián)，主要檢測的是染色質(zhì)上蛋白之間的相互作用。

怎么檢測同一基因組位置的兩個蛋白質(zhì)或不同的組蛋白修飾？

當進行 ChIP 實驗去解碼組蛋白編碼時，證明兩個不同的蛋白質(zhì)或者組蛋白修飾占據(jù)同一個核小體位點是非常有意義的?；蛘撸苍S需要確定一個蛋白質(zhì)和特定的組蛋白修飾是否在同一個調(diào)控元件。

Sequential ChIP（也叫做 Re-ChIP）是一項使用兩個不同抗體進行連續(xù) ChIP 反應的技術，一次 ChIP 反應之后使用特殊 buffer 洗脫沉淀的染色質(zhì)以避免一個抗體對后續(xù) ChIP 的影響。之后加入第二個不同的抗體進行 ChIP。通過兩個不同抗體和兩次 ChIP 反應，得到兩個蛋白或不同組蛋白修飾所在的同一基因組 DNA 片段。

ChIP 能做 RNA 和蛋白質(zhì)相互作用嗎？

有證據(jù)顯示 RNA 導向過程在介導染色質(zhì)結(jié)構和表觀遺傳記憶有重要作用。從染色質(zhì)中純化的核酸含有 2～5% RNA；這些 RNA 是非編碼的序列，在染色質(zhì)結(jié)構和轉(zhuǎn)錄沉默中有重要作用。

然而，因為染色質(zhì)的復雜度以及染色質(zhì)中大量 DNA 的存在，用傳統(tǒng)的 ChIP 技術研究這些 RNA 是很困難的。為了使基因組調(diào)控中 RNA 的功能研究變得可能，我們利用其在 ChIP 的技術研發(fā)了 RNA-ChIP 的一代試劑盒，主要用于研究染色質(zhì)中 RNA-蛋白質(zhì)的相互作用。

RNA-蛋白質(zhì)的相互作用用甲醛固定，染色質(zhì)剪切結(jié)合 DNA 酶處理得到了可以用特異性蛋白抗體免疫沉淀的 RNA/蛋白質(zhì)復合物。隨后進行解交聯(lián)，解交聯(lián)之后的 RNA 再用 DNA 酶處理確保沒有 DNA 污染。