在過去的十年間，分子生物學(xué)領(lǐng)域的一部分重要進(jìn)展來自于單個(gè)細(xì)胞內(nèi)全基因組和全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究。隨著細(xì)胞分離和新一代測(cè)序的進(jìn)步，研究人員不再需要分析來自群體中多個(gè)細(xì)胞的平均信號(hào)，而是可以逐個(gè)細(xì)胞地研究DNA，RNA，蛋白質(zhì)和染色質(zhì)。

  單細(xì)胞基因組學(xué)，表觀基因組學(xué)，轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究揭示出了即使是在同一組織中遺傳相同的細(xì)胞之間，基因和蛋白質(zhì)表達(dá)依然存在差異。但是來自美國(guó)Parker癌癥免疫療法研究所的生物學(xué)家Pier Federico Gherardini指出，目前大多數(shù)此類研究只檢查了每個(gè)細(xì)胞的單層信息，這可能會(huì)產(chǎn)生偏差。“你不能只測(cè)量RNA，就由此推測(cè)蛋白質(zhì)看起來都一樣。”


現(xiàn)階段，科學(xué)家們已經(jīng)開始以單細(xì)胞分辨率組合多層信息。這些“多組學(xué)”技術(shù)可以更仔細(xì)地觀察細(xì)胞之間的可變性，更清楚地識(shí)別特定細(xì)胞及其功能。分析基因組DNA揭示了單細(xì)胞基因組，甲基化組織或染色質(zhì)，而分析RNA和蛋白質(zhì)則能分別產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)。


“多組學(xué)比單一層的組學(xué)分析更強(qiáng)大，”英國(guó)Sanger研究所的分子生物學(xué)家Lia Chappell說，“這樣才能開始解開所有異質(zhì)性的真正含義，能夠深入挖掘生物機(jī)制。”


維也納CeMM分子醫(yī)學(xué)研究中心的基因組研究員Christoph Bock認(rèn)為，單細(xì)胞多組學(xué)特別適用于檢查發(fā)生快速變化的細(xì)胞，如活化的免疫細(xì)胞，或非常異質(zhì)組織中的細(xì)胞，包括腫瘤。


這種方法還可以識(shí)別在大量群體中被掩蓋的罕見但具有生物學(xué)重要性的細(xì)胞。 Chappell說：“一個(gè)典型的例子是那些抗藥性低的細(xì)胞，在群體研究中我們無(wú)法找到它們，因?yàn)樗麄儽簧锨П陡嗟募?xì)胞淹沒了。”


然而，單細(xì)胞多組學(xué)研究并不容易。目前對(duì)于任何單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)，還沒有可用的商業(yè)試劑盒，并且許多技術(shù)還存在限制。研究人員必須修改現(xiàn)有的單細(xì)胞方案，使其與多種類型的分子兼容，并且要非常小心地將樣品的損失或污染降至zui低。


基因組和轉(zhuǎn)錄組

同時(shí)對(duì)來自相同細(xì)胞的DNA和RNA進(jìn)行測(cè)序可以揭示單個(gè)細(xì)胞之間的基因組變異，解釋其轉(zhuǎn)錄水平的變化。這樣做還可以更準(zhǔn)確地檢測(cè)DNA突變。


DR-seq（DNA-mRNA sequencing）這種測(cè)序方法發(fā)表于Nature Biotechnology[1]，通過裂解單細(xì)胞，并同時(shí)擴(kuò)增裂解物中的DNA和RNA。然后將裂解物分成兩半，一個(gè)用于RNA測(cè)序（RNA-seq），另一個(gè)用于基因組測(cè)序。這樣在擴(kuò)增過程中將DNA和RNA保持在一起，可以zui大限度地減少核酸的損失，但可能會(huì)導(dǎo)致潛在的交叉污染。


G＆T-seq（genome and transcriptome sequencing）則是另外一種重要方法[2]，早在2015年生物通就報(bào)道過這種技術(shù)（Nature Methods發(fā)布重磅測(cè)序技術(shù)：基因組和轉(zhuǎn)錄組平行測(cè)序），研究人員當(dāng)時(shí)用G&T-seq對(duì)220個(gè)小鼠和人類細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，獲得了詳細(xì)的信息。


具體來說，這種技術(shù)就是利用涂有結(jié)合mRNA的短寡核苷酸序列的磁珠，物理性地從*裂解的細(xì)胞中分離mRNA和DNA。然后將DNA和mRNA分別擴(kuò)增和測(cè)序。這樣讓保持mRNA和DNA分離，允許研究人員使用他們選擇的方案分析每種分子，但這可能導(dǎo)致核酸的損失。 目前G＆T-seq已實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，通量相對(duì)較高。


表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組

分析細(xì)胞表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組的技術(shù)可以揭示甲基化和染色質(zhì)可接近性（chromatin accessibility，生物通注）對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用。


“在腫瘤發(fā)生等復(fù)雜的生物過程中，異質(zhì)性同時(shí)存在于基因組，表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組中，單獨(dú)分析它們可能不起作用，”北京大學(xué)分子生物學(xué)家湯富酬教授說。基因相同的腫瘤細(xì)胞可能具有不同的DNA甲基化或基因表達(dá)模式，可能需要多組學(xué)技術(shù)才能明確地將它們分類為亞群。


scM＆T-seq（simultaneous single-cell methylome and transcriptome sequencing）能同時(shí)完成單細(xì)胞甲基化組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析[3]，這種方法基于G＆T-seq，采用相同的方法從單個(gè)細(xì)胞中分離DNA和RNA，并擴(kuò)增和測(cè)序RNA。對(duì)基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理，將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為*，然后擴(kuò)增并測(cè)序以測(cè)定甲基化組。


研發(fā)技術(shù)人員表示，“這一新的實(shí)驗(yàn)方案讓你可以并行分析同一單細(xì)胞中的DNA甲基化和RNA。我們的方法提供了有關(guān)單細(xì)胞DNA甲基化異質(zhì)性與特定基因表達(dá)差異之間關(guān)系的shou個(gè)直觀視圖。”（Nature Methods：突破性單細(xì)胞表觀基因組與轉(zhuǎn)錄組分析新技術(shù)）


scNMT-seq（single-cell nucleosome, methylation, and transcription sequencing）則是在scM和T-seq基礎(chǔ)上發(fā)展起來的[4]，不過這種技術(shù)需要將單細(xì)胞分離出來，進(jìn)行處理，檢測(cè)全基因組染色質(zhì)可接近性。不同基因組位置的可接近性，或者保護(hù)性會(huì)影響基因表達(dá)，使用scNMT-seq可以發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎干細(xì)胞中表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組之間的新關(guān)聯(lián)。


scMT-seq（another method of simultaneously sequencing single cells’ methylomes and transcriptomes）是同時(shí)測(cè)序單細(xì)胞的甲基化組和轉(zhuǎn)錄組的另一種方法[5]，這種是加州大學(xué)范國(guó)平教授和同濟(jì)大學(xué)薛志剛教授研發(fā)的，他們利用這種方法對(duì)感覺神經(jīng)元進(jìn)行研究，揭示了細(xì)胞間的轉(zhuǎn)錄組和甲基化組異質(zhì)性。不過，這些差異大多不是啟動(dòng)子甲基化造成的。舉例來說，啟動(dòng)子帶CpG島的基因，表達(dá)水平與基因體甲基化正相關(guān)。這項(xiàng)研究表明，scMT-seq可以用來檢測(cè)單細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄組、甲基化組和單核苷酸多態(tài)性信息，進(jìn)而解析表觀遺傳學(xué)基因調(diào)控機(jī)制。（同濟(jì)大學(xué)發(fā)布單細(xì)胞測(cè)序新技術(shù)）

scTrio-seq（single-cell triple omics sequencing是一種單細(xì)胞三重組學(xué)測(cè)序方法[6]，由北京大學(xué)湯富酬教授等人研發(fā)，這種全新的單細(xì)胞三重組學(xué)測(cè)序方法在上從同一個(gè)單細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)對(duì)三種組學(xué)高通量測(cè)序信息的同時(shí)獲取，并從單細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞在三種組學(xué)上存在密切相互關(guān)聯(lián)的高度異質(zhì)性。


scTrio-seq選擇性裂解細(xì)胞膜，將細(xì)胞質(zhì)中的mRNA與完整細(xì)胞核中的基因組DNA分開。對(duì)于scMT-seq，實(shí)驗(yàn)人員是利用微量移液管收集細(xì)胞核，而在scTrio-seq中，則是通過離心分離細(xì)胞核。兩種情況中，基因組DNA都是進(jìn)行的改良亞硫酸鹽處理和測(cè)序方法來檢測(cè)甲基化組，而來自細(xì)胞裂解物的mRNA則是平行擴(kuò)增和測(cè)序。


“基本上在基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)之間沒有交叉污染，”湯教授表示。scTrio-seq使用甲基化組序列數(shù)據(jù)計(jì)算評(píng)估基因組拷貝數(shù)變異，這種技術(shù)已用于分析人結(jié)直腸癌樣本中的異質(zhì)性。


蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組

還有幾種技術(shù)可以同時(shí)測(cè)定來自單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)。這些方法為科學(xué)家提供了轉(zhuǎn)錄后的研究，分析導(dǎo)致蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄水平之間的差異。


PLAYR（proximity ligation assay for RNA）技術(shù)中，蛋白質(zhì)被不同金屬同位素的抗體標(biāo)記。同時(shí)，RNA轉(zhuǎn)錄物被同位素標(biāo)記的探針結(jié)合。利用一種稱為質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)（mass cytometry）的方法測(cè)量同位素，并且這種技術(shù)也可以同時(shí)檢測(cè)每秒數(shù)千個(gè)單細(xì)胞中的40多種不同的mRNA和蛋白質(zhì)。


CITE-seq（cellular indexing of transcriptomes and epitopes by sequencing）采用寡核苷酸標(biāo)記的抗體靶向細(xì)胞表面蛋白。這種技術(shù)分離并裂解單個(gè)細(xì)胞，并將它們的mRNA和寡標(biāo)記抗體與涂有短寡核苷酸序列的磁珠結(jié)合。擴(kuò)增RNA和抗體標(biāo)簽并按大小分離，通過測(cè)序定量分析蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄物。CITE-seq還可同時(shí)檢測(cè)約100種蛋白質(zhì)以及數(shù)萬(wàn)種RNA轉(zhuǎn)錄物。


Marlon Stoeckius是紐約基因組中心的分子生物學(xué)家，他是這項(xiàng)技術(shù)的研發(fā)者。目前Stoeckius正致力于將該方法擴(kuò)展到細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，不過這需要固定和透化細(xì)胞，這可能會(huì)降低RNA質(zhì)量或?qū)е缕鋸募?xì)胞中滲出。


REAP-seq（RNA expression and protein sequencing assay）類似于CITE-seq，采用寡核苷酸交聯(lián)抗體來檢測(cè)細(xì)胞蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄物水平（基于測(cè)序）。


REAP-seq和CITE-seq都可以檢測(cè)很多的轉(zhuǎn)錄本，但與PLAYR相比，每次檢測(cè)的細(xì)胞數(shù)量更少。


“我認(rèn)為它們是互補(bǔ)的方法，”PLAYR的開發(fā)人員Gherardini說，“如果你有一個(gè)大的隊(duì)列或臨床研究，像PLAYR這樣的東西會(huì)更加經(jīng)濟(jì)有效”。


CITE-seq還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)就是蛋白質(zhì)定量可以在通常單細(xì)胞RNA測(cè)序制備中丟棄的部分進(jìn)行，因此“對(duì)RNA測(cè)序文庫(kù)的質(zhì)量沒有任何損害，”紐約基因組中心的Peter Smibert說，“我們認(rèn)為如果采用RNA-seq作為讀數(shù)，那么就可以使用CITE-seq。”



如何做出選擇

有了這么多種的檢測(cè)方法可供選擇，研究人員還需要根據(jù)他們提出的生物學(xué)問題，特定技術(shù)的成本，勞動(dòng)密集程度和技術(shù)要求來決定使用哪些檢測(cè)方法。


“通常這需要技術(shù)專家團(tuán)隊(duì)，計(jì)算人員和了解實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的生物學(xué)家合作才能很好地完成這些類型項(xiàng)目的研究，”Bock說。


如何制定技術(shù)方案，選擇方法取決于很多因素，各種技術(shù)的實(shí)驗(yàn)指南存在的一大差異是如何從組織中分離單個(gè)細(xì)胞，口腔移液和連續(xù)稀釋是相對(duì)快速，簡(jiǎn)便和低成本的方法，可以zui大限度地降低RNA或蛋白質(zhì)降解的風(fēng)險(xiǎn)，但它們通量也相對(duì)較低。FACS，機(jī)器人操作和微流體是高通量的，但它們很昂貴并且可能在細(xì)胞分離上沒有那么精細(xì)。


成本是另一個(gè)因素?；谥改虾驮噭┑捏w積（例如酶和抗體），上述這些技術(shù)的價(jià)格每個(gè)樣品從幾美元到幾百美元不等（這不包括測(cè)序的成本，當(dāng)然測(cè)序也可能是限制性的問題）。 “沒有多少科學(xué)家能夠從單個(gè)細(xì)胞中測(cè)序十萬(wàn)個(gè)單基因組，”Chappell說。


對(duì)于一批樣品，單細(xì)胞多組學(xué)測(cè)定可以需要花費(fèi)超過24小時(shí)到近一周的時(shí)間，其中涉及手動(dòng)將細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)分離的方法往往較慢，且勞動(dòng)強(qiáng)度較大，而基于FACS的方法更方便，通量更高。


生物信息學(xué)專業(yè)知識(shí)是一個(gè)優(yōu)勢(shì)。 Stoeckius說：“對(duì)于所有的這些分析，你需要一點(diǎn)計(jì)算機(jī)背景和一些R經(jīng)驗(yàn)，”這是一種用于統(tǒng)計(jì)計(jì)算和數(shù)據(jù)分析的編程語(yǔ)言和軟件環(huán)境。


不過這種情況也可能很快就會(huì)改變，因?yàn)樵絹碓蕉嗟娜碎_始使用這種分析，一些公司開發(fā)了易于使用的軟件來分析單細(xì)胞多組學(xué)數(shù)據(jù)。目前，諸如SEURAT和MOFA之類的計(jì)算軟件包可以集成來自兩個(gè)或多個(gè)組學(xué)層的數(shù)據(jù)。


隨著單細(xì)胞單組學(xué)技術(shù)變得更加靈敏，準(zhǔn)確和高通量，相應(yīng)的多組學(xué)技術(shù)也可能得到改善。研究人員還致力于將單細(xì)胞技術(shù)與其它數(shù)據(jù)層相結(jié)合，例如空間信息（如CODEX）和功能分析。將細(xì)胞的空間信息鏈接到其他組學(xué)層可以幫助研究人員在組織內(nèi)映射不同的細(xì)胞類型和功能。


zui終的目標(biāo)還是從單個(gè)細(xì)胞中捕獲所有分子的信息——一種“”的信息，但這仍然需要幾年時(shí)間。目前，單細(xì)胞多組學(xué)正在改變科學(xué)家處理分子生物學(xué)的方式。