土壤樣品含有大量的微生物，其中絕大部分的微生物都是無(wú)法直接培養(yǎng)進(jìn)行繁殖和研究。從土壤樣品中提取 DNA 是研究土壤微生物為有效的方法。目前從土壤樣品中提取微生物 DNA 的方法主要有直接法和間接法。直接法是指把土壤樣品放在裂解液中，經(jīng)過(guò)有效的破壁方法使微生物的DNA 全部釋放到裂解液中，然后再進(jìn)行分離提取，如 Zhou 的方法。間接法是指將土壤放在一種的緩沖液中，如 Buffer PBS 等，把微生物從土壤中分離出來(lái)，然后再進(jìn)行 DNA 的提取。間接法可大大降低土壤中腐殖酸，重金屬鹽對(duì) DNA 提取帶來(lái)的影響，但是這種方法會(huì)丟失許多微生物，得到的 DNA 并非土壤樣品中的全基因組 ( 宏基因組 ) ，目前已經(jīng)很少研究者會(huì)采用這種方法。從土壤樣品中直接提取 DNA 可大可能性地獲得全基因組，但是這種方法卻面臨以下幾個(gè)問(wèn)題：  

1.          腐殖酸的污染。土壤中，特別是森林，草地土壤含有非常豐富的腐殖酸。腐殖酸是一系列的有機(jī)物分子，部分分腐殖酸同核酸分子非常類似，在純化過(guò)程中非常難于去除。微量的腐殖酸污染都會(huì)導(dǎo)致下游應(yīng)用，如 PCR ，酶切的失敗。  

2.          裂解方法。土壤樣品中含有各種微生物，如細(xì)菌和真菌等。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和真菌都含有非常厚的細(xì)菌壁，讓這些微生物的細(xì)胞壁有效破裂是提取高產(chǎn)量宏基因組 DNA 的關(guān)鍵。由于土壤樣品的復(fù)雜性，使用酶法 ( 如*，破壁酶，蝸牛酶 ) 或液氮研磨都不可行，因?yàn)橥寥乐泻懈鞣N金屬離子或抑制因子導(dǎo)致消化酶的活性失活，或土壤中的沙粒等會(huì)導(dǎo)致液氮研磨很難進(jìn)行。  

3.          DNA 得率難于控制。土壤樣品或因肥沃，或因貧瘠，或因含水量豐富，或因干枯，或因取樣的深淺度，都會(huì)造成微生物數(shù)量和品種發(fā)生劇烈改變。在一個(gè)小范圍的土壤樣品 DNA 含量往往會(huì)差別成千上百倍。此外，某些土壤中含有的化學(xué)成分，如重金屬鹽，粘土物質(zhì)都會(huì)造成DNA 得率降低。  

Omega Biotek 公司的 E.Z.N.A. Soil DNA Kit 是目前土壤 DNA 提取為優(yōu)化的試劑盒。該試劑盒采用玻璃珠研磨法和熱激化學(xué)破壁法，可不需特殊的珠磨儀，在點(diǎn)動(dòng)渦旋儀就可進(jìn)行，適合于廣大的研究室。試劑盒中 HTR Reagent 是 Omega Biotek 公司開發(fā)的腐殖酸吸附劑，能去除各種腐殖酸的污染。此外還采用無(wú)醇的硅膠柱純化方式，可去除土壤中各種可溶性金屬鹽，以及其它可溶性的抑制因子。該試劑盒已經(jīng)成功地提取如下土壤 ( 部分是客戶反饋 ) ：自然保護(hù)區(qū)森林的土壤 ( 長(zhǎng)達(dá) 30-40 年森林土壤，表層有 30 -50cm 落葉層 ) ，紅樹林土壤，草地，耕地，海底泥，污泥，礦石區(qū)泥土，有機(jī)物污染的泥土，池塘泥，垃圾泥，空調(diào)管道堆積物等。  

實(shí)驗(yàn)方法  

為表明該試劑盒的優(yōu)勢(shì)性，我們選擇以下不同組織樣品進(jìn)行 DNA 提取實(shí)驗(yàn)，每個(gè)樣品重復(fù) 3 次。  

l           森林類樣品：自然保護(hù)區(qū)森林土壤 ( 廣東黑石頂自然保護(hù)區(qū) ) 和海南島紅樹林保護(hù)區(qū)  

l           礦石區(qū)樣品：礦石區(qū)水底土壤 ( 濕 ) 和礦石區(qū)地表土壤 ( 干 )  

l           耕地樣品：稻田土壤，菜地土壤  

l           有機(jī)物污染地表樣品：污水溝衍泥和生活垃圾堆放區(qū)  

操作方法（按 Soil DNA Kit 試劑盒進(jìn)行）簡(jiǎn)單描述以下：  

1.          取▲ 0.5 g 森林土壤 / 耕地土壤 ，或 ◆ 4g 礦石區(qū)土壤和有機(jī)物污染土壤至 15ml 離心管中；  

2.          加入▲ 0.5g 酸洗玻璃珠，或 ◆ 4g 酸洗玻璃珠；  

3.          加入▲ 1ml Buffer SXL MLus ，或 ◆ 8 ml Buffer SXL MLus ；  

4.          立即在渦旋儀上gao速渦旋 3 分鐘。  

5.          加入▲ 100ul   ，或◆ 800ul Buf fer DS ，渦旋 15s 混勻  

6.          轉(zhuǎn)移至預(yù)熱至 70 ^oC 水浴鍋中，水浴 10-15 分鐘。  

7.          3000 x g 離心 3 分鐘，轉(zhuǎn)移▲ 800ul ，或◆ 7 ml 上清，并加入▲ 270ul Buffer SP2 或◆ 2.3 ml Buffer SP2 ，渦旋混勻；  

8.          ▲ 10,000 x g 離心 5 分鐘，或 ◆ 5 ， 000 x g 離心 10 分鐘；  

9.          把上清液轉(zhuǎn)稱至新的 2ml/15ml 離心管中，加入 0.7 倍的異丙醇。 ( 在處理礦石區(qū)樣品時(shí)和有機(jī)物污染的樣品中，還加入 133ul 糖原溶液 )，渦旋混勻；  

10.       ▲ 10,000 x g 離心 5 分鐘，或 ◆ 5 ， 000 x g 離心 10 分鐘沉淀收集 DNA 。  

11.       倒棄上清液，并反扣于吸水紙上 5 分鐘；  

12.       加入 200 ul Elution Buffer ，渦旋 5 秒。 6 5 ℃ 水浴 20-60 分鐘，讓 DNA 充分溶液。  

13.       加入 50ul HTR, 反應(yīng) 2min 后，離心，取上清。  

14.       上清加入等體積（約 200ul ） XP2 Buffer ，均勻后上柱。  

15.       加入 300ul XP2 Buffer ，洗滌一次。  

16.       加入 700ul SPW Wash Buffer ，洗滌兩次。  

17.       空甩后，加入適當(dāng)量的 Elution Buffer 洗脫即可。  

實(shí)驗(yàn)結(jié)果  

1.        DNA 電泳結(jié)果  

取 10 ul 純化的基因組 DNA 上樣于 0.8% 瓊脂糖凝膠， 80V 電泳 30 分鐘，結(jié)果如下。  

0.5g 森林類土壤樣品  

( 前兩個(gè)自然保護(hù)區(qū)森林土壤，后兩個(gè)為紅樹林土壤 )  

0.5g 耕地類土壤樣品  

A: 水稻田土壤  

B: 玉米土壤  

4g 有機(jī)物污染土壤樣品  

A: 生活垃圾堆放地  

B: 污水溝底泥  

4g 礦石泥  

1 和 3 是兩個(gè)礦石區(qū)水底土壤 ( 濕 )  

2 和 4 礦石區(qū)地表土壤 ( 干 )  

2.        DNA 純度和產(chǎn)量分析