細(xì)胞：過表達(dá)就是把基因上調(diào)表達(dá)，即該基因被過度的轉(zhuǎn)錄、翻譯，終基因表達(dá)產(chǎn)物超過正常水平。做過表達(dá)要比做干擾難度高一些，過表達(dá)需要表達(dá)出長(zhǎng)鏈的 mRNA，這一點(diǎn)比較困難，而干擾只需表達(dá)出短片段的 shRNA 即可。

一般情況下，如果本身就是高表達(dá)，你再做過表達(dá)就比較困難，某種程度上干擾更為重要，想說(shuō)明一個(gè)基因?qū)τ谝粋€(gè)事件是必須的，只有把它拿掉，事件終止（或程度減弱），才比較有說(shuō)服力。但是，如果你的基因在細(xì)胞中基礎(chǔ)表達(dá)本身就不高的話，還是有必要來(lái)選擇過表達(dá)實(shí)驗(yàn)來(lái)對(duì)其表型進(jìn)行驗(yàn)證的，否則實(shí)驗(yàn)會(huì)受到質(zhì)疑。

關(guān)于下調(diào)基因表達(dá)，一般來(lái)說(shuō)干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)株能滿足實(shí)驗(yàn)所需。但是，干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)株不能控制 shRNA 插入染色體的位置，染色體上的 shRNA 有時(shí)會(huì)丟失，另外 shRNA 也有脫靶效應(yīng)，可能干擾了其他未知基因。還有就是，shRNA 是與目的基因的 mRNA 作用而使之降解，是在 RNA 水平上的降低目的基因的表達(dá)。

此時(shí)，基因敲除穩(wěn)轉(zhuǎn)株可以很大程度上規(guī)避這個(gè)問題。因?yàn)榛蚯贸€(wěn)轉(zhuǎn)株是在基因組水平上通過基因序列的改變使其基因功能喪失，在敲除細(xì)胞中通常不會(huì)檢測(cè)到靶蛋白的表達(dá)，而且敲除效果穩(wěn)定，不能恢復(fù)，也就是yong久性敲除了。但是基因敲除穩(wěn)轉(zhuǎn)株缺點(diǎn)是操作周期長(zhǎng)，費(fèi)用多，效率低。如何選擇基因下調(diào)表達(dá)的方式，就要綜合考慮了。

那么同樣是穩(wěn)定株，單克隆？混合克??？要怎么選？

細(xì)胞：當(dāng)需要去除細(xì)胞群體干擾因素的時(shí)候，*使用單克隆穩(wěn)定細(xì)胞株，其基因組背景相對(duì)單一，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果干擾因素小。當(dāng)進(jìn)行系統(tǒng)生物學(xué)研究時(shí)，需考慮細(xì)胞群體因素，同時(shí)也是由于不同細(xì)胞個(gè)體差異大，而且不同整合位點(diǎn)的單克隆細(xì)胞株表現(xiàn)出來(lái)的細(xì)胞行為可能不一致，所以許多實(shí)驗(yàn)使用混合克隆株更能去除細(xì)胞間差異造成的干擾。因此，選擇單克隆細(xì)胞株還是混合克隆細(xì)胞株，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ā?/span>

好極了，怎么判別篩選的穩(wěn)定株是單克隆呢？

細(xì)胞：如果外源片段含有熒光標(biāo)記，可以直接使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其熒光是否均一；如果還有其它標(biāo)簽，可以進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，再使用流式細(xì)胞儀觀察熒光分布是否出現(xiàn)均一峰值；

如果外源片段不含任何標(biāo)簽或者熒光標(biāo)記，則可以使用分子生物學(xué)比如 Southern Blot 的方法鑒定； 還可使用 96 孔板稀釋法篩選，得到的陽(yáng)性克隆一般是單克隆。