【儀器網(wǎng) 珀金埃爾默】
細(xì)胞的3D模型培養(yǎng)能夠更好地模擬微環(huán)境、細(xì)胞間相互作用和體內(nèi)生物過程。相較于生化檢測和2D模型，3D模型可提供更具生理相關(guān)性的條件。此外，其形態(tài)學(xué)和功能分化程度更高，這也賦予了它們更接近體內(nèi)細(xì)胞的特征。如今越來越多的研究人員正在應(yīng)用3D細(xì)胞培養(yǎng)、微組織和類器官技術(shù)來填補(bǔ)2D細(xì)胞培養(yǎng)與體內(nèi)動(dòng)物模型之間的差距。 特別是類器官的研究和使用，類器官(Organoid)是源自干細(xì)胞的體外衍生3D細(xì)胞聚集體，具有類似器官結(jié)構(gòu)和功能。近年來，3D類器官培養(yǎng)技術(shù)逐漸成熟，正在成為藥物篩選、個(gè)性化治療和發(fā)育研究的重要模型。
然而，細(xì)胞的3D培養(yǎng)技術(shù)面臨著諸多挑戰(zhàn)：首先，培養(yǎng)一致的、可再現(xiàn)的3D 微組織十分困難，尤其是類器官的培養(yǎng)；此外，大而厚的細(xì)胞
樣品成像難度極高；同時(shí)，處理3D細(xì)胞實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)則是嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。
針對(duì)3D微組織樣品，使用傳統(tǒng)的冰凍切片染色成像或直接使用共聚焦顯微鏡進(jìn)行成像都有很多挑戰(zhàn)：冰凍切片成像無法獲得立體樣品的全部信息，特別是Z軸的細(xì)胞位置信息；共聚焦顯微鏡有較高的光毒性和光漂白，不能對(duì)立體樣品反復(fù)多層的成像，成像的層數(shù)有很大限制；此外，這兩種拍攝方法獲取的大量圖片還需借助其他分析軟件對(duì)其數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和統(tǒng)計(jì)，分析通量很低；重要的是，這兩種方法掃描速度都很慢，通量很低，一個(gè)3D微組織的掃描分析時(shí)間長達(dá)幾個(gè)小時(shí)，限制了3D微組織研究的開展。
高內(nèi)涵
細(xì)胞成像能夠在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整性的前提下，對(duì)細(xì)胞和亞細(xì)胞層次進(jìn)行多通道、多靶點(diǎn)的熒光全面掃描，檢測細(xì)胞形態(tài)、生長、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等各個(gè)環(huán)節(jié)，在單一實(shí)驗(yàn)中獲取大量相關(guān)信息。在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞毒作用、受體蛋白轉(zhuǎn)位、蛋白相互作用等方面都有很好的應(yīng)用，被證明是細(xì)胞生物學(xué)，癌癥研究，病原生物學(xué)，藥物研發(fā)，系統(tǒng)生物學(xué)，心血管疾病研究，干細(xì)胞研究，神經(jīng)細(xì)胞研究等領(lǐng)域的重要研究工具。
PerkinElmer公司提供的高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析系統(tǒng)，它采用Nipkow轉(zhuǎn)盤掃描技術(shù)配以高靈敏度sCMOS探測器，能夠快速捕捉到細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的生物學(xué)過程，更因其降低光漂白和光毒性的特點(diǎn)，配合水浸式高數(shù)值孔徑物鏡，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞、小型模式生物和3D微組織樣品進(jìn)行高通量的共聚焦高分辨率成像。再結(jié)合強(qiáng)大的Harmony分析軟件，能夠?qū)?xì)胞和亞細(xì)胞層面各種復(fù)雜的表型進(jìn)行群體性統(tǒng)計(jì)分析研究。該系統(tǒng)在細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域有著非常廣泛的應(yīng)用。
PerkinElmer高內(nèi)涵系統(tǒng)的3D方案不僅僅局限于3D微組織，包括模式生物、細(xì)胞偽足等立體結(jié)構(gòu)都可以通過高內(nèi)涵系統(tǒng)完成全面的檢測和分析：
珀金埃爾默的單細(xì)胞ICP-MS技術(shù)，基于業(yè)界的細(xì)胞脈沖信號(hào)讀取速度(可達(dá)100000點(diǎn)每秒)，能定量單個(gè)細(xì)胞中低至阿克級(jí)別的
金屬和納米顆粒含量，測定細(xì)胞群中金屬質(zhì)量分布和含金屬細(xì)胞的數(shù)量，從而評(píng)估與量化細(xì)胞群的異質(zhì)程度。適用于人體、動(dòng)物、植物等各種組織器官細(xì)胞的深入研究。
例如，含金屬藥物和納米顆粒越來越廣泛的應(yīng)用于癌癥的治療和檢測，單細(xì)胞ICP-MS可進(jìn)行精細(xì)跟蹤，掌握病變組織在細(xì)胞層面上對(duì)藥物的吸收和代謝，有助于了解癌癥機(jī)理和提升治療水平。
兩株卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780( 順鉑敏感型)和A2780/CP70 (順鉑耐藥型)隨時(shí)間變化順鉑攝入量
生物體中的銅含量通過非常有效而復(fù)雜的穩(wěn)態(tài)機(jī)制得以嚴(yán)格調(diào)控，該機(jī)制可控制元素的吸收、分布和排出。目前數(shù)據(jù)得到的細(xì)胞銅穩(wěn)態(tài)模型只是一個(gè)“骨架” ，用SC-ICP-MS來測量外周血單核細(xì)胞(PBMC)中的銅(Cu)含量，對(duì)了解穩(wěn)態(tài)機(jī)制的失調(diào)或失衡可能導(dǎo)致生物體功能異常，并可能與某些疾病(例如炎癥、哮喘、衰老過程、癌癥等)方面提供了進(jìn)一步研究的有效手段。
外周血單核細(xì)胞(PBMC)中銅的含量
應(yīng)用領(lǐng)域舉例：
3D微組織類器官目前的應(yīng)用主要集中在腫瘤研究(藥篩模型、藥篩、腫瘤免疫、個(gè)體化醫(yī)療)、干細(xì)胞和發(fā)育生物學(xué)、體外模型研究(感染模型、毒性評(píng)價(jià))、材料及給藥研究等方面：
腫瘤研究
2019年6月17日，Cell Death and Disease雜志在線發(fā)表了錢其軍研究組的研究成果Modified CAR T cells targeting membrane proximal epitope of mesothelin enhances the antitumor function against large solid tumor。該工作致力于優(yōu)化腫瘤CAR T免疫療法。
MSLN(Mesothelin，間皮素)是嵌合抗原受體(CAR)T治療的誘人抗原，MSLN中的表位選擇至關(guān)重要。在這項(xiàng)研究中，作者使用修飾的piggyBac轉(zhuǎn)座子構(gòu)建了兩種針對(duì)MSLN的I區(qū)(meso1 CAR，也稱為膜遠(yuǎn)端區(qū)域)或MSLN的III區(qū)(meso3 CAR，也稱為膜近端區(qū)域)的兩種類型的CAR系統(tǒng)。其中，meso3 CAR T細(xì)胞在激活后表達(dá)更高水平的CD107α，并在體外針對(duì)表達(dá)多種MSLN的癌細(xì)胞產(chǎn)生更高水平的白介素2，TNF-α和IFN-γ。
之后，作者構(gòu)建了胃癌和卵巢癌3D腫瘤細(xì)胞模型，并用該模型來測試這兩種CAR T系統(tǒng)，通過PerkinElmer Opera Phenix高內(nèi)涵系統(tǒng)完成3D腫瘤 CART殺傷系統(tǒng)的成像和分析，終證明在3D細(xì)胞水平，meso3 CAR T細(xì)胞比meso1 CAR T細(xì)胞具有更高的殺傷作用。
后續(xù)的研究中，作者借助PerkinElmer Xenogen IVIS成像系統(tǒng)，在胃癌NSG小鼠模型中進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證，同樣證明與meso1 CAR T細(xì)胞相比，meso3 CAR T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤反應(yīng)更強(qiáng)。我們進(jìn)一步確定meso3 CAR T細(xì)胞可以有效地抑制體內(nèi)大卵巢腫瘤的生長。
總體而言，本研究證明meso3 CAR T細(xì)胞療法在治療MSLN陽性實(shí)體瘤方面比meso1 CAR T細(xì)胞療法具有更好的免疫療法，為實(shí)體瘤的免疫治療提供了新的有效的CAR T療法。
干細(xì)胞與發(fā)育生物學(xué)
2018年11月，英國的格拉斯哥大學(xué)癌癥科學(xué)研究所在Nature Communication雜志發(fā)表了名為《The Phospholipid PI(3,4)P 2 Is an Apical Identity Determinant》的文章，本文主要以MDCK囊腫為模型，研究了上皮細(xì)胞的極化機(jī)制，終發(fā)現(xiàn)PI(3,4)P2磷脂酶是決定上皮細(xì)胞極化發(fā)生的重要分子，并闡明了其調(diào)控機(jī)制。
在本文中，作者首先發(fā)現(xiàn)磷酸酯修飾酶PI(3,4)P2的分布在上皮細(xì)胞極化的過程中是至關(guān)重要的，接下來，他們用PI(3,4)P2的分布作為表型，篩選哪些蛋白的敲除影響其分布。該過程是通過PerkinElmer的Opera Phenix高內(nèi)涵系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)的，作者先通過高內(nèi)涵系統(tǒng)的預(yù)掃描成像功能對(duì)微球進(jìn)行智能的層切式掃描，選取橫截面大的那一層，然后把細(xì)胞分區(qū)域，分細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)側(cè)、外側(cè)和細(xì)胞連接處等等，然后計(jì)算每個(gè)區(qū)域的熒光強(qiáng)度。作者使用此方法去分析一些突變過的微球的磷脂酶分布，發(fā)現(xiàn)一些重要的上游蛋白(如PIP蛋白)被敲掉后，會(huì)發(fā)生顯著的定位變化。
除此以外，作者還利用高內(nèi)涵系統(tǒng)分析了微球的空腔表型，MDCK囊腫包含多少個(gè)空腔直接反映了其功能是否正常，只有極化正常發(fā)生的囊腫才能有正常的空腔。同樣的，作者使用高內(nèi)涵預(yù)掃描成像功能對(duì)所有球做了層切式掃描，選取有空腔的這些層，把它們壓到一起，然后通過算法選出空腔，分析其數(shù)量。作者也用該方法做了一系列基因的篩選，篩選到幾個(gè)顯著影響空腔形成的基因，并在后續(xù)闡明了其調(diào)控機(jī)制。
體外模型研究——肝損傷模型
2018年，王韞芳課題組在新刊Advanced Biosystems雜志上發(fā)表封面文章，研究展示一種新型的藥物性肝損傷研究模型——LBS微肝球模型(Liver biomatrices scaffolds, LBSs)。該模型在HepaRG細(xì)胞的基礎(chǔ)上引入天然脫細(xì)胞肝臟支架，可進(jìn)行肝細(xì)胞的長期3D培養(yǎng)。在LBS提供的肝組織特異微環(huán)境下，新模型具有更高的生理相關(guān)性和毒理預(yù)測敏感度。
作者使用PerkinElmer Operetta CLS 高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)，深入評(píng)估了8種抗抑郁藥物的肝毒性。結(jié)合特定的染料組合，從細(xì)胞活力、凋亡、膽汁蓄積、脂肪變、氧化應(yīng)激和線粒體毒性6個(gè)方面檢測藥物處理對(duì)微肝球模型的影響。其中的許多參數(shù)都使用了復(fù)雜的高內(nèi)涵分析方法。結(jié)果證明LBS微肝球模型能高度特異預(yù)測藥物肝毒性和協(xié)助進(jìn)一步的毒理機(jī)制研究。
本研究還用到了PerkinElmer的Engisht多功能成像酶標(biāo)儀，研究利用Alamar blue法追蹤不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞活力的變化。
PerkinElmer提供的分子及細(xì)胞水平檢測方案貫穿本論文藥物肝毒性研究的整個(gè)過程。從微肝球模型的細(xì)胞增殖、酶活分析，再到3D模型的功能驗(yàn)證和毒理學(xué)多指標(biāo)分析，PerkinElmer均能提供針對(duì)性的應(yīng)用方案。
材料及給藥研究
2019年6月，愛爾蘭都柏林大學(xué)學(xué)院生物與環(huán)境科學(xué)學(xué)院&康威研究所在Small雜志發(fā)表名為《A High‐Throughput Automated Confocal Microscopy Platform for Quantitative Phenotyping of Nanoparticle Uptake and Transport in Spheroids》的文章。該研究利用PerkinElmer高內(nèi)涵Opera Phenix系統(tǒng)，構(gòu)建了完整的在3D微組織層面研究納米載體攝取和運(yùn)輸?shù)哪Ｐ汀?br />
作者首先進(jìn)行3D微組織培養(yǎng)和高內(nèi)涵拍攝的優(yōu)化，主要研究了培養(yǎng)條件和固定方法對(duì)不同濃度的基質(zhì)膠的影響，并根據(jù)該實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定了培養(yǎng)方法、固定方法和基質(zhì)膠濃度及用量。
此外，作者也通過順式到反式高爾基標(biāo)記物(GM130、GalT和TGN46)的分布染色考察了高內(nèi)涵的拍攝質(zhì)量，證明PerkinElmer高內(nèi)涵系統(tǒng)確實(shí)有極高的分辨率，用來研究納米顆粒的攝取情況是足夠的。
接下來，作者通過Harmony軟件對(duì)層切掃描圖片進(jìn)行重構(gòu)分析，獲取大亮度投影和3D重構(gòu)視圖，在此基礎(chǔ)上定量測量球狀體中NP吸收和滲透。
后，作者選擇了在納米顆粒胞吞作用中有功能的蛋白，通過RNAi沉默進(jìn)行潛在基因篩選，確定該模型可用于評(píng)估3D微球NP的攝取和運(yùn)輸過程。
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