本產(chǎn)品是采用 SYBR Green I 嵌合熒光法進行Real Time PCR的專用試劑，將熱啟動Taq DNA聚合酶、dNTP、SYBR Green I等試劑預(yù)混成即用的2x Mix，可對目標cDNA進行快速并具有高特異性的定量檢測。本產(chǎn)品采用化學(xué)修飾的Hot Start Taq DNA聚合酶，在 50 ℃以下無活性，只有 95 ℃條件下加熱后才能*恢復(fù)酶的活力，*大限度減少非特異性擴增產(chǎn)物的產(chǎn)生，提高熒光定量PCR反應(yīng)的精確性。該試劑盒*的反應(yīng)緩沖液，可在寬范圍中得到良好的擴增結(jié)果、檢測靈敏度更高、信號更強。
產(chǎn)品組分：
產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
1 | 2×SYBR Green qPCR Mix | 5 x 1ml |
2 | 50×ROX Reference Dye | 1ml |
保存條件：
收到本產(chǎn)品后，請立即置于-20℃避光保存，一年有效，2～8℃條件下儲存6個月，避免反復(fù)多次凍融。
使用說明：
一、配制 Real-Time PCR反應(yīng)體系：
1、將所有試劑2×SYBR Green qPCR Mix，ROX Reference Dye，模板，引物和RNase-Free ddH2O，在室溫下融解并*混勻，避免產(chǎn)生氣泡。短暫離心后，置于冰上按照下表配制反應(yīng)液。
參考下表配制反應(yīng)體系：
組分 | 20ul體系 | 50ul體系 | 終濃度 |
SYBR Green qPCR Mix | 10μl | 25 μl | 1× |
Primer F (10 μM)* | 0.4~0.8 μl | 1.5 μl | 0.2~0.4 uM* |
Primer R (10 μM)* | 0.4~0.8 μl | 1.5 μl | 0.2~0.4 uM* |
50 x ROX Reference Dye** | － | － | － |
cDNA模板 | － | － | -- |
RNase-Free ddH2O | 至20 μl | 至50 μl | － |
* 一般來說反應(yīng)體系中引物終濃度為0.2 uM即可得到較好的擴增效果。當反應(yīng)性能比較差時，可以在終濃度0.2~0.4 uM范圍內(nèi)調(diào)整引物濃度。
** 幾種常見儀器的*適ROX Reference Dye濃度見下表：
儀器型號 | 使用濃度 |
ABI PRISM 7000/7300/7700/7900HT/StepOne/ StepOne Plus等 | 5×（20ul體系加2ul，50ul體系加5ul） |
ABI 7500/7500 Fast、QuantStudio ® 3/5、QuantStudio 6/7 Flex、ViiA 7、Stratagene Mx3000P/Mx3005P和Mx4000等 | 1×（20ul體系加0.4ul，50ul體系加1ul） |
Roche、Bio-Rad、Eppendorf等 | 無需添加 |
2、蓋上或密封反應(yīng)管/PCR板，輕輕混勻。短暫離心，確保所有組分都在管/板底。
二、進行Real-Time PCR反應(yīng)
1、建議采用兩步法PCR反應(yīng)程序進行反應(yīng)。
兩步法反應(yīng)程序:
步驟 | 溫度 | 持續(xù)時間 | 循環(huán)數(shù) |
預(yù)變性 | 95℃ | 5min | 1 |
變性 | 95℃ | 10sec | 40 |
退火延伸數(shù)據(jù)采集 | 60℃ | 30sec | 40 |
熔解曲線分析 | 根據(jù)儀器推薦程序設(shè)置 |
若模板量較低等因素導(dǎo)致擴增效果不佳，可使用三步法程序進行PCR反應(yīng)。
三步法反應(yīng)程序:
步驟 | 溫度 | 持續(xù)時間 | 循環(huán)數(shù) |
預(yù)變性 | 95℃ | 5min | 1 |
變性 | 95℃ | 10sec | 40 |
退火 | 50-60℃ | 30sec | 40 |
延伸數(shù)據(jù)采集 | 72℃ | 30sec | 40 |
熔解曲線分析 | 根據(jù)儀器推薦程序設(shè)置 |
2、上機檢測：將反應(yīng)體系置于熒光定量 PCR 儀中，運行程序收集數(shù)據(jù)并分析結(jié)果。
