Western及IP細(xì)胞裂解液
別名：Cell lysis buffer for Western and IP
產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
Western及IP細(xì)胞裂解液(Cell lysis buffer for Western and IP)，是一種在非變性條件下裂解細(xì)胞的裂解液。本細(xì)胞裂解液裂解的細(xì)胞，可以用于PAGE，Western，免疫沉淀(immunol precipitation，IP)和免疫共沉淀(co-IP)。
Western及IP細(xì)胞裂解液的主要成分為20mM Tris (pH7.5)，150mM NaCl，1% Triton X-100，以及sodium pyrophosphate，β-glycerophosphate，EDTA，Na3VO4，leupeptin等多種抑制劑。可以有效抑制蛋白的降解，并維持原有的蛋白間相互作用。用Western及IP細(xì)胞裂解液裂解得到的蛋白樣品，可以用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。由于含有較高濃度的Triton X-100等干擾物質(zhì)，不能用Bradford法測(cè)定由本裂解液裂解得到樣品的蛋白濃度。
使用說(shuō)明：
對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞樣品：
1、融解Western及IP細(xì)胞裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。
2、對(duì)于貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍(若血清中的蛋白沒(méi)有干擾，可不洗)。按照6孔板每孔加入100-200ul裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。通常裂解液接觸細(xì)胞1-2秒后，細(xì)胞就會(huì)被裂解。
對(duì)于懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，用手指把細(xì)胞用力彈散。按照6孔板每孔細(xì)胞加入100-200ul裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后應(yīng)無(wú)明顯的細(xì)胞沉淀。如果細(xì)胞量較多，必需分裝成50-100萬(wàn)細(xì)胞/管后再裂解。大團(tuán)的細(xì)胞較難裂解充分，而少量的細(xì)胞由于裂解液容易和細(xì)胞充分接觸，相對(duì)比較容易裂解充分。
3、充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
裂解液用量說(shuō)明：通常6孔板每孔細(xì)胞加100ul裂解液已經(jīng)足夠，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到150或200ul。
對(duì)于組織樣品：
1、把*切成細(xì)小的碎片。
2、融解Western及IP細(xì)胞裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。
3、按照每20mg組織加入100-200ul裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。)
4、用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。
5、充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
6、如果組織樣品本身非常細(xì)小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解，通過(guò)強(qiáng)烈vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。直接裂解的優(yōu)點(diǎn)是比較方便，不必使用勻漿器，缺點(diǎn)是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。
注意事項(xiàng)：
1、為取得*佳的使用效果，盡量避免過(guò)多的反復(fù)凍融?？梢赃m當(dāng)分裝后使用。
2、需自備PMSF。
3、裂解樣品的所有步驟都需在冰上或4℃進(jìn)行。
4、可能需要通過(guò)一些預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)摸索*佳的適合您實(shí)驗(yàn)條件的裂解液。
5、為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
保存條件：
-20℃保存，一年有效。
