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質(zhì)譜成像技術(shù)應(yīng)用于成年果蠅大腦中GABA的可視化分析
黑腹果蠅(以下簡稱果蠅)是一種被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)各個領(lǐng)域的模型動物。作為一種模型動物，果蠅有很多優(yōu)點(diǎn)，比如，它的生命周期短，只有10天左右，它的基因重組技術(shù)已得到確定，培育和創(chuàng)建新模型的成本不高，而且從動物倫理學(xué)角度來看，不存在任何問題。由于研究人員已經(jīng)掌握與果蠅相關(guān)的遺傳知識和基因重組技術(shù)，因此可將其廣泛用作模型生物，用于研究阿爾茨海默癥、帕金森病和肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)等神經(jīng)退行性疾病(1)。
神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)退行性疾病中扮演重要角色。舉例來說，*，γ-氨基丁酸(GABA)作為一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，對各種生物行為和神經(jīng)退行性疾病都產(chǎn)生影響(2)。
為了確定GABA在大腦中的功能，不僅需要研究大腦中的GABA濃度，還需要研究其空間定位。因此，我們認(rèn)為了解GABA在果蠅頭部的位置信息，對于理解GABA在各種疾病模型中所起的作用至關(guān)重要。
雖然研究人員已采用免疫組織化學(xué)染色和熒光標(biāo)記成像技術(shù)來研究GABA在果蠅頭部的空間定位信息，但這些傳統(tǒng)方法主要通過觀察GABA合成酶GAD1(3)或GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體(4)而間接分析GABA的分布。因此，近年來基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜成像(MALDI-MSI)法，作為一種直接檢測目標(biāo)分子的技術(shù)，在非哺乳動物模型生物體生物分子的可視化分析中備受關(guān)注。
圖1顯示了MALDI-MSI的工作流程。使用此方法時，首先對樣品材料進(jìn)行切片，通過激光照射，用離子化輔助劑(基質(zhì))對樣品切片中的分子進(jìn)行解吸和電離，然后用質(zhì)譜檢測這些分子。在組織上連續(xù)進(jìn)行激光照射，得到的系列解吸/電離后的離子并進(jìn)行質(zhì)譜檢測，并通過提取質(zhì)譜圖中m/z強(qiáng)度信息并結(jié)合位置信息，獲取顯示分子空間分布的二維圖像。由于MALDI-MSI通常不需要熒光標(biāo)記或其他可視化標(biāo)簽，且分子本身離子化后可被質(zhì)譜檢測，因此該項(xiàng)技術(shù)被認(rèn)為對直接觀察成年果蠅頭部的GABA有所幫助。在以前的研究中，其他研究小組通過使用MALDI-MSI 成功實(shí)現(xiàn)對小鼠大腦中的GABA進(jìn)行可視化分析(5)。
然而，到目前為止，MALDI-MSI應(yīng)用于成年果蠅頭部GABA可視化分析還存在一些困難。首先，對于通過福爾馬林固定法和石蠟包埋法(FFPE)等方法固定的樣本，進(jìn)行MALDI-MSI分析很困難，因?yàn)镚ABA等小分子代謝物在脫蠟過程中容易被沖洗掉。而且，由于果蠅頭部非常小(≤1mm3)，很難制備MALDI-MSI分析中常用的冷凍切片(6)。除了樣本大小問題之外，果蠅頭部還覆蓋有堅硬的角質(zhì)層。這些堅硬的角質(zhì)層中的腦細(xì)胞沒有中間絲，而且由于這些腦細(xì)胞相對于哺乳動物的腦細(xì)胞更加柔軟，因此，果蠅頭部和大腦的硬度有很大的差異。
基于以上特征，在保持成年果蠅頭部形態(tài)的同時制備其切片非常困難。Cryo-tape冷凍切片膠帶(Leica)通常被用于制備這類樣本的切片。然而，市售冷凍切片膠帶包含一層非導(dǎo)電膜，放置在此類材料支撐介質(zhì)上樣品，其表面的離子強(qiáng)度會被大幅度降低。造成這種現(xiàn)象的原因被認(rèn)為是由于絕緣體的存在和樣品板上的電場擾動，導(dǎo)致樣品表面帶電所引起。
此外，MALDI方法對GABA的離子化效率很低，且果蠅頭部的GABA含量相對比哺乳動物少，這通過它們腦部相對大小的差異便可想象。這也是直接可視化分析果蠅大腦中GABA分布的難點(diǎn)。因此，即使可以對嚙齒類動物大腦中的GABA進(jìn)行直接離子化和MALDI-MSI分析，仍不清楚是否可以在果蠅頭部檢測到GABA。
本應(yīng)用報告介紹了我們小組之前發(fā)表的可視化分析果蠅腦部GABA空間分布的內(nèi)容(7)。我們研究了解決上述果蠅腦部切片制備難題的方法并直接獲取組織切片，優(yōu)化了原位組織衍生化方法以提高GABA的離子化效率。此外，本文還概述了當(dāng)前原位組織衍生化方法，包括其顯著特點(diǎn)。
1.樣品制備方法
1.1制備切片
用鑷子分割果蠅頭部，立即將其浸入70%乙醇中。然后，將其頭部置于填充有4%羧甲基纖維素(4%CMC)的一次性模具(base mold，As One Corp.)中進(jìn)行包埋。包埋后，將模具包裹在鋁箔中，用液氮快速冷凍。將冷凍樣本在-20℃下放置1小時，然后使用冷凍切片機(jī)(CM1950, Leica)將樣本切成15μm的薄片。分別將冷凍箱和樣品頭的溫度設(shè)置為-18℃和-16℃。
我們研究了兩種切片方法，一種方法使用Cryofilm，另一種使用防卷板Anti-roll bar(圖2)。將通過這兩種方法制備的切片放置在帶有氧化銦錫透明導(dǎo)電層的玻璃載玻片(ITO，Matsunami Glass)上，并使用恒溫器在40℃的條件下干燥5分鐘。使用雙面導(dǎo)電膠帶(3M)將Cryofilm獲取的切片固定于ITO玻璃載玻片上。
1.2原位組織衍生化
衍生化試劑采用2,4-二苯基吡喃四氟硼酸鹽(DPP-TFB)(8)，并且為了將GABA 與其結(jié)構(gòu)異構(gòu)體區(qū)分開來，也采用了4-羥基-3-甲氧基肉桂酸(CA)(9)。DPP-TFB儲備液使用甲醇溶液調(diào)整至10mg/mL，儲存在-30℃?zhèn)溆谩Ｊ褂?00μL超純水、900μL甲醇和1μL三乙胺的混合液作為溶劑配制DPP-TFB溶液，并將它與儲備液混合達(dá)到69:6的比例。DPP-TFB 溶液使用噴槍(Procon BOY PS270, Creos)進(jìn)行霧化。進(jìn)行噴霧時，在噴嘴與組織表面之間保持15cm的距離。
在每個切片上用50μL溶液。進(jìn)行噴霧后，將樣品在填充了50%甲醇蒸汽的腔室內(nèi)放置60分鐘，以加快衍生化反應(yīng)。進(jìn)行衍生化后，在每個切片上噴上20μL的10%乙酸以酸化組織。
CA溶液以甲醇為溶劑，由11.5mg/mL的CA和4.25mg/mL的反式阿魏酸(trans-FA)制備而成(9)。與DPP溶液一樣，CA溶液也需用噴槍噴霧。噴霧后，將樣品在室溫下放置10分鐘，以進(jìn)行衍生化反應(yīng)。
1.3用于DPP-GABA檢測的基質(zhì)涂敷
通過MALDI-MSI方法觀察微小樣品(例如果蠅頭部)中含有的生物分子時，基質(zhì)涂敷方法極為重要，因?yàn)榻M織上基質(zhì)晶體的聚集體會產(chǎn)生干擾。為了解決此問題，我們采用了兩步基質(zhì)涂敷法：首先是使用 iMLayer™(圖3)進(jìn)行基質(zhì)升華，第二步是對基質(zhì)溶液進(jìn)行噴霧(10)。衍生化反應(yīng)后的樣品，使用iMLayer 進(jìn)行升華，在組織表面沉積厚度為0.5μm的α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)。在升華期間，含有基質(zhì)粉末的基質(zhì)盒的溫度設(shè)置為250℃。使用iMLayer進(jìn)行升華后，在第二步中，用噴槍在每個切片上噴涂50μL的CHCA溶液。使用0.1%甲酸和60%超純水、30%乙腈和10% 2-丙醇的混合物作為溶劑，將CHCA溶液的濃度調(diào)整為10mg/mL。
1.4MSI 分析條件
MALDI-MSI分析使用了iMScope TRIO™(圖4)。像本文中描述的微小樣本的成像分析中，顯微鏡觀察到的光學(xué)圖像與MSI的結(jié)合是非常重要。iMScope TRIO對于此類應(yīng)用分析很有效。MALDI使用的激光為Nd: YAG(波長：355nm，頻率：1kHz)。激光照射次數(shù)設(shè)置為200，累計次數(shù)設(shè)置為1/像素。激光照射直徑為1(約10μm)，激光強(qiáng)度為25，激光斑點(diǎn)間隔為20μm。樣品電壓和檢測器電壓分別為3.5kV和2.1kV。DPP衍生化樣品的檢測質(zhì)量范圍為m/z 100-330，CA衍生化樣本的檢測質(zhì)量范圍為m/z 140-270，MS/MS分析在正離子模式下進(jìn)行。對于DPP-GABA和CA-GABA，前體離子分別設(shè)置為 m/z 318.15和m/z 264.12。
2.結(jié)果和討論
2.1切片方法的研究
前面的章節(jié)描述了在保持良好形態(tài)的同時對成年果蠅頭部進(jìn)行切片的難度，這是因?yàn)闃颖倔w積小且大腦的硬度和頭部的外部結(jié)構(gòu)之間差異較大。進(jìn)行MSI分析時，在切片過程中維持良好的形態(tài)非常重要，這不僅是為了觀察檢測神經(jīng)遞質(zhì)，而且還是為了獲取有關(guān)分子空間定位的準(zhǔn)確信息。由于目前尚未報告適合成年果蠅頭部低分子量MALDI-MSI分子的切片方法，本文研究了一種適合于MALDI-MSI的切片方法。
對果蠅之類的顯微樣本進(jìn)行組織切片時，通常會對樣本進(jìn)行包埋和冷凍。但該方法存在問題，因?yàn)楣壣眢w上覆蓋的硬毛會排斥包埋劑，而且由于樣本與包埋劑之間存在間隙，無法進(jìn)行穩(wěn)定的切片。因此，我們證實(shí)了如下情況，將樣本浸入70%乙醇后再包埋4% CMC時，可以使樣本表面與包埋劑之間緊密粘合。
研究認(rèn)為，通過用70%的乙醇潤濕表皮角質(zhì)層，可實(shí)現(xiàn)在不排斥包埋劑的情況下包埋樣品。為了避免形成冰晶而對組織造成損傷，使用液氮法快速冷凍包埋的樣本。然后，再用兩種不同的方法對成年果蠅頭部進(jìn)行切片，從而進(jìn)行比較研究，一種方法使用防卷板，另一種方法使用 Cryofilm。在優(yōu)化了冷凍箱溫度和樣本頭溫度(圖5A、B)的前提下，這兩種方法均成功獲得了形態(tài)保持完好的組織切片。尤其是，使用Cryofilm 的方法更容易制備出形態(tài)良好的切片，因?yàn)楸∧ふ吃跇悠飞喜⑵鸬街误w的作用。然而，從圖5C中峰值強(qiáng)度的比較可以看出，在使用Cryofilm獲得的樣品中，DPP-GABA產(chǎn)生的峰值強(qiáng)度明顯較低。
研究認(rèn)為，造成這種差異的原因是Cryofilm 作為電絕緣體造成充電(如前所述)，以及形成的離子進(jìn)入質(zhì)量分離部分而引起電場擾動?；谏鲜鼋Y(jié)果，我們得出如下結(jié)論：使用防卷板的方法更適合用于成年果蠅頭部MALDI-MSI切片的制備，并且我們在以下實(shí)驗(yàn)中使用了該方法。
2.2通過 DPP 衍生化方法可視化分析成年果蠅頭部和腦部的GABA
研究者通常認(rèn)為，使用MALDI-MSI 很難對果蠅頭部的GABA進(jìn)行分析，這是因?yàn)闃颖局械腉ABA量少、支持解吸/電離的基質(zhì)所產(chǎn)生的峰造成干擾以及GABA電離效率低。為解決這些問題，我們嘗試使用GABA 的標(biāo)準(zhǔn)溶液建立一種針對通過DPP衍生化的GABA (DPP-GABA)的MALDI-MSI分析方法，進(jìn)一步通過組織衍生化提高電離效率。將配制好的DPP溶液噴涂在果蠅頭部的切片上并在室溫下進(jìn)行60分鐘衍生化反應(yīng)，然后涂敷基質(zhì)并嘗試可視化分析DPP-GABA。然而，與小鼠研究不同的是，在果蠅身上無法獲得足夠的離子強(qiáng)度。研究者認(rèn)為造成這一問題的原因之一是成年果蠅大腦中脂質(zhì)含量高，從而可能對衍生化反應(yīng)或電離效率產(chǎn)生影響。換句話說，需要進(jìn)一步優(yōu)化才能檢測果蠅大腦中的微量GABA。
因此，修改了衍生化反應(yīng)的條件。在填充50%甲醇蒸汽的腔室中進(jìn)行衍生化來促進(jìn)其反應(yīng)，并在衍生化后的樣品上噴涂10%乙酸進(jìn)行組織酸化，從而保持衍生化的GABA正電離的狀態(tài)。
進(jìn)行這些措施后，可以清楚地識別出m/z 232.11的峰，即DPP-GABA 衍生的峰(圖6A)。并且通過MALDI-MSI分析可以成功地可視化分析DPP-GABA 衍生物的峰在成年果蠅腦部(圖6B)和頭部(圖6C)的局部分布。圖6中的結(jié)果顯示，DPP-GABA衍生的信號分布在整個果蠅大腦中。
已知果蠅中的GABA由谷氨酸脫羧酶(GAD)產(chǎn)生，而GAD分布在整個大腦中。對整個頭部進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，GAD也存在于大腦和大腦周圍的局部組織中。為了滿足果蠅大腦對能量和氧氣的較高需求，大腦由血管和氣管系統(tǒng)進(jìn)行能量和氧氣供應(yīng)(11)。以前對果蠅幼蟲的研究中顯示，GABA被分泌到循環(huán)血淋巴中(12)，由于這種現(xiàn)象也發(fā)生在成年果蠅中，因此推測GABA 可能也分布在成年果蠅的整個大腦中。
2.3通過CA衍生化方法可視化分析成年果蠅頭部和腦部的GABA
如前所述，通過DPP衍生化方法可以實(shí)現(xiàn)GABA衍生信號的可視化分析。然而，由于存在GABA的同分異構(gòu)體(例如2-氨基丁酸、2-氨基異丁酸和3-氨基丁酸)，該方法本身并不支持其同分異構(gòu)體的可視化分布。由于使用DPP衍生化方法時通過MS/MS分析檢測到的m/z 232.11峰是DPP 產(chǎn)生的碎片離子(圖6A)，因此無法通過MS/MS區(qū)分GABA的同分異構(gòu)體。然而，根據(jù) Maier等人的報告，如果將CA用作衍生化試劑，則可以區(qū)分GABA與其同分異構(gòu)體(9)。
根據(jù)參考文獻(xiàn)9，將m/z 264.12選作前體離子，在MS/MS分析中檢測到產(chǎn)物離子m/z 161、178、191 和 209離子。其中，m/z 191 和 209 為特異性峰，可區(qū)分 GABA 的同分異構(gòu)體。
因此，使用 DPP 衍生化方法獲得的結(jié)果，在此實(shí)驗(yàn)中通過 CA 衍生化結(jié)果得到了驗(yàn)證。圖7顯示了通過CA-GABA分析獲得的產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖，以及m/z 264.12>191.07 在成年果蠅大腦和頭部的分布。與DPP衍生化分析一樣，在CA衍生化分析中，GABA也分布于整個大腦和頭部(圖7A、B)。
在果蠅大腦切片中獲得的m/z 264.12的產(chǎn)物離子也得到驗(yàn)證。結(jié)果顯示，來自2-氨基丁酸和2-氨基異丁酸的m/z 218.2離子，以及來自3-氨基丁酸的m/z 190.09離子，兩者*未被檢測到?？梢酝茰y，成年果蠅大腦中不存在2-氨基丁酸、2-氨基異丁酸和3-氨基丁酸，或者它們存在的量極小，低于iMScope TRIO的檢測限。
基于 DPP-TFB 和 CA 分布的相似性，以及成年果蠅大腦中未檢測到 2-氨基丁酸、2-氨基異丁酸和 3-氨基丁酸，這一結(jié)果可以認(rèn)為，本實(shí)驗(yàn)成功地對果蠅大腦中 GABA 分布進(jìn)行了具體可視化分析。這些結(jié)果證實(shí)，組織衍生化方法對 MALDI-MSI 可視化分析果蠅頭部 GABA 是*的。
3.組織衍生化方法的當(dāng)前狀態(tài)和*性
衍生化是GC、LC、GC-MS和 LC-MS普遍采用的一種方法。在分析方法中使用衍生化的目的是通過引入官能團(tuán)改變待測物質(zhì)的極性或揮發(fā)性，或通過引入能發(fā)出熒光的官能團(tuán)增強(qiáng)分辨率或檢測靈敏度。在MSI中，樣本表面被直接電離，形成的離子未經(jīng)過色譜法等化學(xué)分離即被進(jìn)行檢測。然而，MSI過程存在一個問題，易被電離分子的離子化會抑制目標(biāo)分子的電離，因此，可檢測分子樣本的范圍大大縮小。即使在今天，很多使用MSI的研究將重點(diǎn)仍然放在磷脂檢測，其中一個原因就是由于在組織表面存在大量磷脂，而它們的分子中含有一個帶固定電荷的極性基團(tuán)，從而實(shí)現(xiàn)高靈敏度檢測。另一方面，由于上述電離抑制效應(yīng)，對某些類型的物質(zhì)來說，不經(jīng)衍生而直接從組織中檢測分子有時非常困難。除了本文中研究的神經(jīng)遞質(zhì)之外，這些物質(zhì)還包括氨基酸和類固醇激素，它們都是中極性物質(zhì)。近報告了各種解決此問題的組織衍生化方法。表 1 總結(jié)了幾種代表性衍生化試劑。
首先，除了本報告中討論的 DPP 和 CA 之外，TAHS 也可以作為氨基基團(tuán)的衍生化試劑 (13), (14)。由于TMA在其分子結(jié)構(gòu)中具有固定的正電荷，TAHS 可以增強(qiáng)電離作用。如參考文獻(xiàn) 14 所描述，在 55 ℃ 的條件下進(jìn)行過夜孵育衍生，然后噴涂 2,5-二羥基苯甲酸并進(jìn)行 MALDI-MSI 分析(14)。
也可以對氨基基團(tuán)以外的官能團(tuán)進(jìn)行衍生。Girard 試劑 T (GirT) 是一種代表性試劑，它被用于類固醇激素的 MSI 分析 (15)。
GirT在C3位點(diǎn)時對羰基具有高反應(yīng)性，即使在類固醇激素中也如此，它也能有效用于睪酮和皮質(zhì)酮的MSI 分析(16)-(18)。在使用GirT的MS/MS分析中，主要檢測到丟失TMA的[M-59]+離子，可通過對該峰進(jìn)行進(jìn)一步碎裂(即MS/MS/MS分析)來分離同分異構(gòu)體(圖8)(18)。關(guān)于其他官能團(tuán)的衍生，一種對酚羥基進(jìn)行衍生化的試劑被報道。
雖然目前很多詳細(xì)信息不明，也沒有發(fā)表任何與此試劑相關(guān)的論文，但據(jù)報告，該試劑表現(xiàn)出*的反應(yīng)活性，反應(yīng)在試劑被噴涂在組織表面后立即完成。
4.結(jié)論
我們的團(tuán)隊(duì)*建立了使用MALDI-MSI可視化分析成年黑腹果蠅頭部GABA的方法。使用4% CMC 包埋成年果蠅的頭部切片，然后使用液氮快速冷凍這些樣本。我們還使用防卷板成功制備了成年果蠅頭部切片，并保留了其完好的形態(tài)。雖然GABA的離子化比較困難，但我們通過利用GABA的原位組織衍生化來提高其離子化效率，成功實(shí)現(xiàn)成年果蠅頭部GABA的可視化分析，從而證實(shí)了GABA在整個果蠅頭部的空間分布。未來有望利用此方法可視化分析作為神經(jīng)退行性疾病研究模型生物果蠅大腦中的GABA水平。
本論文還對目前使用的組織衍生化試劑進(jìn)行了總結(jié)。隨著這些新的樣品前處理方法的出現(xiàn)，以前無法實(shí)現(xiàn)的生物分子的分布現(xiàn)在也可進(jìn)行可視化分析。在MSI領(lǐng)域，目前正在積極開發(fā)基質(zhì)和新的衍生化試劑。未來，我們還將開發(fā)可應(yīng)用于多種領(lǐng)域的新樣本前處理方法。
參考資料
文獻(xiàn)題目
《質(zhì)譜成像技術(shù)應(yīng)用于成年果蠅大腦中 GABA的可視化分析》
使用儀器
島津iMScope TRIO
作者
Yosuke Enomoto *1、Masamitsu Yamaguchi *2、Eiichiro Fukusaki *1、Shuichi Shimma *1¡
*1: 大阪大學(xué)工程研究生院生物技術(shù)系
*2: 京都工藝?yán)w維大學(xué)應(yīng)用生物系
¡：通信作者
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