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　摘要：結(jié)合國(guó)外糞大腸菌群的酶底物檢測(cè)方法，針對(duì)某次突發(fā)環(huán)境污染事件，用酶底物法和標(biāo)準(zhǔn)多管發(fā)酵法同步檢測(cè)受污染地表水中的糞大腸菌群，討論酶底物法在應(yīng)急檢測(cè)中檢測(cè)糞大腸菌群的適用性。結(jié)果表明，兩種方法的測(cè)定數(shù)據(jù)顯著相關(guān)，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異ρ＞0.05。相對(duì)于多管發(fā)酵法，酶底物法特異性強(qiáng)，檢測(cè)時(shí)間短，二次污染少，符合應(yīng)急檢測(cè)的要求。
應(yīng)急監(jiān)測(cè)指突發(fā)環(huán)境事件發(fā)生后,對(duì)污染物種類、濃度和污染范圍進(jìn)行的監(jiān)測(cè)。
糞大腸菌群又稱耐熱大腸菌群,是水質(zhì)污染的重要指標(biāo)之一,也是環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和排放標(biāo)準(zhǔn)中*的控制指標(biāo)之一?？焖?、準(zhǔn)確地檢測(cè)糞大腸菌群直接關(guān)系突發(fā)水環(huán)境污染事件中水體的糞便污染評(píng)價(jià),以及采取的應(yīng)急措施和生活用水的安全。
在目前國(guó)內(nèi)已頒布的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中,糞大腸菌群檢測(cè)多選用經(jīng)典方法多管發(fā)酵法和濾膜法,操作較繁瑣,需要48h~72h才能獲得結(jié)果,難以滿足突發(fā)性環(huán)境污染事故監(jiān)測(cè)及時(shí)、準(zhǔn)確的要求。酶底物法是一種新型酶技術(shù)檢測(cè)方法,2003年從美國(guó)引入我國(guó),用于大腸桿菌檢測(cè)。該方法利用糞大腸菌群在44.5℃生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase),分解培養(yǎng)液中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG),使培養(yǎng)液呈現(xiàn)黃色反應(yīng)(陽(yáng)性),從而指示糞大腸菌群的存在。
在美國(guó),90%以上的實(shí)驗(yàn)室使用酶底物檢測(cè)技術(shù);在加拿大、日本的飲用水市場(chǎng),酶底物法的使用率高于其他檢測(cè)方法的總和;在我國(guó),該法也日益普及,擁有相關(guān)設(shè)備的各級(jí)環(huán)境監(jiān)測(cè)站達(dá)百余家,目前已作為檢測(cè)水中總大腸菌群的標(biāo)準(zhǔn)方法列入《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB5749-2006)。使用酶底物法檢測(cè)水中糞大腸菌群尚未正式列入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),使酶底物法的應(yīng)用范圍受到限制。
為了建立糞大腸菌群簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確的快速檢測(cè)法,以標(biāo)準(zhǔn)中的Colilertech酶底物法為基礎(chǔ),通過(guò)某水體一次污染事故中糞大腸菌群的連續(xù)監(jiān)測(cè)過(guò)程分析,將酶底物法與多管發(fā)酵法作比對(duì),探討糞大腸菌群酶底物快速檢測(cè)法在應(yīng)急監(jiān)測(cè)中運(yùn)用的可行性,為酶底物法行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的編制提供技術(shù)參考。
1研究方法和設(shè)備
1.1儀器高壓滅菌器1臺(tái),培養(yǎng)箱2臺(tái),立科封口機(jī),移液器,振蕩器等。
1.2樣品水樣來(lái)源于受污染的地表水,按照《水質(zhì)采樣技術(shù)指導(dǎo)》(HJ494-2009)的規(guī)定采集約
500mL水樣,置于滅菌采樣瓶中,在0℃~4℃低溫保存,送至實(shí)驗(yàn)室分析。
1.3檢測(cè)方法
1.3.1酶底物法基于標(biāo)準(zhǔn)中的Colilertech酶底物法,培養(yǎng)基由西安立科公司提供。目前立科酶底物培養(yǎng)基已經(jīng)獲得《水和廢水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)法》認(rèn)可。檢測(cè)時(shí)用100mL無(wú)菌稀釋瓶量取100mL水樣,加入(2.7±0.5)g培養(yǎng)基粉末,混搖均勻使其*溶解后,全部倒入97孔無(wú)菌定量盤內(nèi),用立科封口機(jī)封口,放入培養(yǎng)箱中于(44.5±1)℃培養(yǎng)24h后判讀結(jié)果。
2試驗(yàn)結(jié)果和分析
2.1試驗(yàn)結(jié)果共采集124個(gè)水樣,分別用酶底物法和多管發(fā)酵法測(cè)定糞大腸桿菌,結(jié)果見圖1,線性回歸分析見圖2。由圖2可見,兩種方法的測(cè)定數(shù)據(jù)在指數(shù)水平上呈現(xiàn)明顯的一致性,測(cè)定結(jié)果之間有較好的趨勢(shì)性,線性回歸方程為y=1.3355x-209.77,R2為0.7588,相關(guān)性較為顯著。


2.2可信度檢驗(yàn)分別用NSI公司和ERA公司提供的糞大腸菌群質(zhì)控標(biāo)樣,對(duì)酶底物法和多管發(fā)酵法進(jìn)行方法質(zhì)控,陰性檢測(cè)和陽(yáng)性檢測(cè)的結(jié)果見表1。由表1可見,酶底物法和多管發(fā)酵法的檢測(cè)結(jié)果均在質(zhì)量控制可信度區(qū)間內(nèi),可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。
2.3兩種方法比對(duì)分析運(yùn)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件,對(duì)酶底物法和多管發(fā)酵法做配對(duì)t檢驗(yàn)分析,結(jié)果見表2。表1兩種方法的可信度檢驗(yàn)MPN/100mL方法檢測(cè)結(jié)果QC值置信范圍結(jié)果評(píng)判酶底物法(NSI公司)579681182~2560良好多管發(fā)酵法(ERA公司)490797346~1250良好表2兩種方法的t檢驗(yàn)結(jié)果Table2ttestofthetwomethods成對(duì)差分均值標(biāo)準(zhǔn)差均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差差分的95%置信區(qū)間下限上限t值dfP值-0.044200.663800.05961-0.162200.07379-0.7421230.460

由表2可見,兩種方法的相關(guān)度為0.836,P值為0.460,表明二者相關(guān)性良好,兩種方法無(wú)顯著性差異。
因此,將酶底物法用于環(huán)境中糞大腸菌群檢測(cè),方法可行,結(jié)果可信。
2.4環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)判讀根據(jù)《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB3838-2002),對(duì)124個(gè)樣品的酶底物法和多管發(fā)酵法檢測(cè)結(jié)果作標(biāo)準(zhǔn)評(píng)判比較,變化率為0.8%~6.5%,在可接受范圍內(nèi)(見表3)。此次被檢樣品的水質(zhì)介于Ⅱ類~Ⅴ類之間,與上海地區(qū)地表水糞大腸菌群評(píng)價(jià)結(jié)果的范圍基本一致。表3酶底物法和多管發(fā)酵法的標(biāo)準(zhǔn)評(píng)判比較

水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)類別Ⅰ類Ⅱ類Ⅲ類Ⅳ類Ⅴ類(劣Ⅴ類)酶底物法樣品數(shù)n/個(gè)7702423占比/%5.656.519.418.5多管發(fā)酵法樣品數(shù)n/個(gè)5632531占比/%4.050.820.225.03討論從結(jié)果一致性的角度,酶底物法與多管發(fā)酵法沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異,此次樣品檢測(cè)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的多管發(fā)酵法與酶底物法的比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果具有較好的一致性。從檢測(cè)原理上分析,多管發(fā)酵法主要基于糞大腸桿菌分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的生化原理,而酶底物法則應(yīng)用酶技術(shù),利用糞大腸桿菌產(chǎn)生β-半乳糖苷酶,分解鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷使培養(yǎng)基顯色的原理檢測(cè),反應(yīng)專性更強(qiáng)。因此,相對(duì)于多管發(fā)酵法15%的假陽(yáng)性和10%的假陰性,酶底物法出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性的現(xiàn)象較少,僅占2%。從實(shí)驗(yàn)操作的角度,多管發(fā)酵法需要重復(fù)接菌,造成污染的幾率較大,而酶底物法取樣加藥后封口培養(yǎng),過(guò)程簡(jiǎn)單,較少受人為污染。

從檢測(cè)結(jié)果分析,雖然二者均采用較大可能數(shù)法,但多管發(fā)酵法的較大可能數(shù)表僅有56組,該試驗(yàn)采用的酶底物法97孔定量盤的較大可能數(shù)表有2352組,其統(tǒng)計(jì)概算結(jié)果更加準(zhǔn)確。由此可見,與多管發(fā)酵法相比,酶底物法操作簡(jiǎn)便,檢測(cè)速度較快,二次污染少,準(zhǔn)確性較高。雖然酶底物法材料成本略高,但綜合考慮管理和人員成本,仍在可接受范圍內(nèi),可以作為應(yīng)急環(huán)境監(jiān)測(cè)中微生物污染的快速監(jiān)測(cè)方法。兩種方法的比較見表4。

采用酶底物法檢測(cè)糞大腸菌群時(shí),需注意以下幾點(diǎn):
(1)樣品的均勻性。水樣需搖勻,并盡快與培養(yǎng)基混合,否則可能導(dǎo)致結(jié)果差異性很大,喪失方法的穩(wěn)定性優(yōu)勢(shì)。
(2)稀釋比的合理性。研究發(fā)現(xiàn),水樣稀釋倍數(shù)越高,酶底物法的測(cè)定值越偏低。因此,在日常檢測(cè)工作中,應(yīng)根據(jù)具體情況對(duì)水樣做小倍數(shù)稀釋,使結(jié)果更加準(zhǔn)確、真實(shí)。
(3)培養(yǎng)溫度的恒定性。樣品在培養(yǎng)箱中于44.5℃培養(yǎng),誤差控制在±0.5℃,溫度偏低或偏高都直接影響檢測(cè)結(jié)果。
檢測(cè)方法操作步驟場(chǎng)所和人員要求確認(rèn)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)時(shí)間準(zhǔn)確度檢測(cè)費(fèi)用推廣度多管發(fā)酵法繁瑣專業(yè)場(chǎng)所和人員需要48h~72h較準(zhǔn)確較便宜易酶底物法簡(jiǎn)易要求不高不需要24h準(zhǔn)確較便宜。
4結(jié)語(yǔ)
酶底物法以糞大腸菌群的特異性酶與特異性底物產(chǎn)生特異反應(yīng)為原理,具有檢測(cè)快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。方法操作簡(jiǎn)便,檢測(cè)周期短,能準(zhǔn)確判斷水樣受糞便污染狀況,符合突發(fā)性環(huán)境應(yīng)急監(jiān)測(cè)實(shí)時(shí)、快速、準(zhǔn)確的要求,將得到更為廣泛和標(biāo)準(zhǔn)化的應(yīng)用。糞大腸菌群酶底物法在環(huán)境應(yīng)急監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用結(jié)合國(guó)外糞大腸菌群的酶底物檢測(cè)方法,針對(duì)某次突發(fā)環(huán)境污染事件,用酶底物法和標(biāo)準(zhǔn)方法多管發(fā)酵法同步檢測(cè)受污染地表水中的糞大腸菌群,討論酶底物法在應(yīng)急監(jiān)測(cè)中檢測(cè)糞大腸菌群的適用性。結(jié)果表明,兩種方法的測(cè)定數(shù)據(jù)顯著相關(guān),沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。相對(duì)于多管發(fā)酵法,酶底物法特異性強(qiáng),檢測(cè)時(shí)間短,二次污染少,符合應(yīng)急監(jiān)測(cè)的要求。