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Thorlabs 激光掃描

原創(chuàng) Imaging Thorlabs索雷博

激光掃描成像基礎(chǔ)

不同于寬場顯微鏡通過泛光照明和相機(jī)同時采集全視場圖像的是，激光掃描顯微鏡通常在給定時間內(nèi)只能用單焦點(diǎn)照明，并在完成逐行光柵式掃描(Raster Scan)后重構(gòu)圖像。光柵掃描一般通過兩個反射鏡(雙軸振鏡)實(shí)現(xiàn)。比如在右下圖中，快速反射鏡沿x軸掃描，慢速反射鏡逐行推進(jìn)。

寬場成像                         激光掃描成像

激光掃描成像相比寬場成像并沒有本質(zhì)上的*性，但通過激光掃描能使用更高水平的成像技術(shù)，而共聚焦和多光子就是本文將要介紹的兩種。共聚焦成像通過抑制焦點(diǎn)外的光產(chǎn)生高分辨率的圖像，可通過光學(xué)切片重構(gòu)三維圖像，而雙光子成像深度非常大。

寬場顯微圖形                       共聚焦顯微圖像

激光掃描引擎：規(guī)格的相互制約

掃描引擎的四個主要光學(xué)組件分別是掃描反射鏡(振鏡)、掃描透鏡、套筒透鏡和物鏡。掃描反射鏡位于掃描透鏡的后焦平面上，掃描透鏡和套筒透鏡的間距等于掃描透鏡前焦距與套筒透鏡后焦距之和。雖然套筒透鏡輸出準(zhǔn)直光束，物鏡處于 wu 窮 遠(yuǎn)校正空間，所以兩者間距沒有那么嚴(yán)格的要求，但 zui hao 使套筒透鏡前焦平面和物鏡后焦平面重合。

下圖畫出了每種組件的相對位置以及掃描角度的關(guān)系。掃描反射鏡的角度Ω1將按照掃描引擎的放大率減小為Ω2，即光束進(jìn)入物鏡的角度。

掃描引擎的視場經(jīng)常受限于掃描光學(xué)元件而不是物鏡。掃描反射鏡既有 zui 大的離軸角，還因?yàn)楣鈻攀綊呙柰ǔ．a(chǎn)生方形的掃描區(qū)域，即下圖中的紫色方框，而掃描透鏡和物鏡的視場是圓形，分別表示為下圖中藍(lán)色和紅色的圓形。

如果掃描透鏡和套筒透鏡的放大率為1，雖然這樣不會減小光束進(jìn)入物鏡的角度，但會限制進(jìn)入物鏡的 zui 大 光束尺寸，使之無法充滿物鏡后孔徑而降低分辨率。這是因?yàn)槲镧R后孔徑充滿均勻的平頂光才能達(dá)到衍射 ji 限 分辨率。而且，軸向分辨率比橫向分辨率受此影響更大。

物鏡分辨率(焦斑)和入射光束的關(guān)系

另外，實(shí)際樣品還會引入散射和波前畸變而造成散焦。這個問題可能和數(shù)值孔徑相關(guān)。對于折射率變化很大的生物組織，從高數(shù)值孔徑入射的光線可能在焦點(diǎn)處造成相消干涉，從而擾亂波前并擴(kuò)大焦斑。未充滿的物鏡可能沒有這些高數(shù)值孔徑的光線，因此提供 geng 好 的波前和更小的焦斑。

光束未充滿物鏡                        光束充滿物鏡

因此，分辨率與成像深度也是兩個互相制約的因素，兩者的關(guān)系形象地展示在下圖中。光束過度充滿物鏡時可在組織表面附近得到高分辨率圖像，但由于散射和其它波前誤差無法太深入組織成像。光束未充滿物鏡時具有低分辨率，但成像更深。

掃描引擎：主要元件的性質(zhì)

在介紹每個掃描組件之前先看下Thorlabs Bergamo®多光子顯微鏡的掃描引擎設(shè)計(jì)規(guī)格：

掃描透鏡多數(shù)屬于fθ校正的類型。這是因?yàn)楹唵吻蛎嫱哥R的焦平面是曲面，雖然平場透鏡可校正場曲，但其焦點(diǎn)的距離與掃描角度不是線性關(guān)系也不是理想選擇。另外，有些掃描引擎還使用遠(yuǎn)心透鏡，使光垂直于像平面聚焦。這樣光束可 gao 效 地通過光學(xué)元件，不會從系統(tǒng)外圍逸出。掃描透鏡的重要規(guī)格為焦距、入瞳直徑、視場數(shù)和設(shè)計(jì)波長范圍。

各種掃描透鏡

套筒透鏡 shou 先 也要關(guān)注焦距，因?yàn)樗绊憭呙枰娴姆糯舐?。di 二 是掃描透鏡和套筒透鏡中間像平面的視場大小，這兩種透鏡的視場 bi 須 匹配才能實(shí)現(xiàn) gao 效 率掃描。第三是入瞳直徑，這其實(shí)是指物鏡這一側(cè)的光瞳，它要和物鏡后孔徑一樣大。第四是設(shè)計(jì)波長范圍。

兩種套筒透鏡

掃描反射鏡有兩種：共振掃描反射鏡(Resonance Mirror)和振鏡掃描反射鏡(Galvo Mirror)。前者用于平行于x軸快速掃描，后者用于逐行推進(jìn)并提供回程。

Thorlabs高速共振掃描頭

振鏡(Galvo)反射鏡可以 jing 確 控制掃描位置，但速度和加速度都比較慢，而且尺寸和速度是互相制約的。掃描引擎?zhèn)鬏數(shù)墓馐叽缡軖呙璺瓷溏R尺寸限制，但使用大鏡面又會降低速度。共振(Resonance)反射鏡速度快，角度和時間為正弦關(guān)系。共振掃描只能控制振幅，而且越高的頻率會使振幅略微降低。

掃描反射鏡通常以兩軸集成在一個掃描頭中。振鏡掃描儀(Galvo-Galvo)和共振掃描儀(Galvo-Resonance)是兩種常見配置。振鏡掃描儀可掃描視場中的任意點(diǎn)并停留任意時間，也能掃描任意形狀，但速度慢。共振掃描儀速度快，但只能掃方形、矩形或直線，而且要沿軸向掃描。

振鏡掃描任意形狀                      共振掃描特定形狀

振鏡掃描儀由于加速度有限需要時間減速，因此會超出視場范圍很多。左下圖展示了利用振鏡掃描儀故意漂白的圖像，黃色方框代表成像區(qū)域，但比較明顯的是，實(shí)際掃描從兩側(cè)延伸出去了。

共振掃描儀在不同位置的停留時間差異很大，右上圖是8 kHz共振掃描儀采集的圖像。視場中間的停留時間約為0.1 μs，邊緣的停留時間超過2 μs。由于掃描停留時間非常短，因此樣品不容易被漂白。仔細(xì)看圖中有兩條暗線，使用高速功率調(diào)制器件可在視場邊緣關(guān)閉激光而減少樣品損傷。

激光掃描探測器要求速度快，在每個像素的停留時間通常不到0.1 μs，而且需要大傳感器區(qū)域捕獲盡可能多的光子。光電倍增管是激光掃描顯微鏡的傳統(tǒng)選擇。它們提供納秒級上升和下降時間以及高動態(tài)范圍和低讀出噪聲，但缺點(diǎn)是量子 xiao 率 zui 高 jin 有 40%左右。

光電倍增管的替代品包括雪崩光電二極管。雖然這種探測器具有更高的量子效率，且速度很快，但動態(tài)范圍較低，超過極低的光強(qiáng)范圍就可能被損壞。近年來，硅光電倍增管有了很大的發(fā)展。

共聚焦掃描引擎

共聚焦的目的是抑制焦點(diǎn)外的光，從而獲得更清晰的圖像。這是因?yàn)槿绻麡悠份^厚，焦點(diǎn)外的光打到探測器會使圖像模糊。共聚焦的實(shí)施方法是在像平面加一個針孔，使得只有來自焦平面的樣品光能通過掃描引擎在針孔上聚焦并進(jìn)入探測器。焦點(diǎn)之外的光大部分都被針孔外側(cè)阻擋。

下面是共聚焦掃描和探測的動態(tài)圖。整個系統(tǒng)既適合視場中心點(diǎn)，也適合焦平面的其它點(diǎn)。當(dāng)掃描反射鏡偏轉(zhuǎn)時，并且激光通過掃描引擎從離軸方向激發(fā)樣品時，發(fā)射光仍能沿 wan 全 相同的路徑通過二向色鏡準(zhǔn)確地聚焦在針孔上。

軸向共聚焦掃描                               離軸共聚焦掃描

共聚焦可通過Z-stack重構(gòu)3D圖像

多光子掃描引擎下面分別是單光子和雙光子成像的電子能級圖。對于單光子成像，gao 能 量藍(lán)色光子將基態(tài)電子躍遷至激發(fā)態(tài)，然后在熒光壽命時間內(nèi)弛豫至略低的能級，zui 后 從這里回到基態(tài)并發(fā)射一個能量略低的綠色光子。

對于雙光子成像，兩個低能量近紅外光子可實(shí)現(xiàn)和上述藍(lán)光一樣的躍遷過程，而發(fā)射光子的能量高于近紅外光子。雙光子激發(fā)需要高峰值功率的脈沖激光才能實(shí)現(xiàn)。

多光子成像由于使用長波長因此能更深入組織成像，而且提供 tian 然 的光學(xué)切片功能。在下面的對比圖中，單光子成像的激發(fā)區(qū)域呈沙漏形，而雙光子成像只能看到焦點(diǎn)處的亮光。這是因?yàn)橹挥薪裹c(diǎn)處的光子密度高才能實(shí)現(xiàn)雙光子激發(fā)，因此這是一種固有的光學(xué)切片，不會在焦點(diǎn)外產(chǎn)生熒光，也不用加針孔。

單光子和雙光子

實(shí)際樣品成像對比

雖然在理想情況下探測器要以球面包圍樣品才能收集全部的光，但大多數(shù)多光子顯微鏡只是通過物鏡收集。和共聚焦探測方式(De-scanned)不同的是，多光子顯微鏡直接在物鏡后用二向色鏡使熒光通過收集透鏡進(jìn)入探測器。

Non-Descanned探測方式

多光子提供深度成像，上面為1.2 mm深的腦圖像

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