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　　原代細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用

　　1、為研究生物體細(xì)胞的生長、代謝、繁殖提供有力的手段；

　　2、為傳代培養(yǎng)創(chuàng)造條件；

　　3、服務(wù)于臨床實踐，用于藥物篩選等。

　　原代細(xì)胞培養(yǎng)之分離注意事項

　　1、組織塊培養(yǎng)法

　　1）組織塊接種后的前3天，在觀察和移動的過程中，注意不要引起液體的振蕩。要避免經(jīng)常翻動和振動，否則組織塊不易附著于瓶壁上或附著后也會脫落飄起。

　　2）加入的培養(yǎng)液不宜過多，避免浸泡的組織塊受輕微的波動而脫落下來。

　　3）當(dāng)細(xì)胞向外遷徙出來后要注意記錄并去除漂浮的組織塊和殘留的細(xì)胞，它們產(chǎn)生的有毒物質(zhì)會影響原代細(xì)胞的生長。

　　4）為促進(jìn)組織塊盡快粘貼在培養(yǎng)瓶皿上，可以在種植前先將膠原薄層涂在培養(yǎng)瓶底壁上。

　　2、貼壁型原代細(xì)胞

　　1)原代培養(yǎng)的分離細(xì)胞在初次接觸體外環(huán)境時，它們之間會互相影響，在這些細(xì)胞之間能產(chǎn)生一些促生長的活性物質(zhì)，使細(xì)胞彼此互相促進(jìn)存活和生長。如果接種的細(xì)胞密度過低，細(xì)胞之間的促生長作用很小，也很難使細(xì)胞適應(yīng)從體內(nèi)的組織環(huán)境到被分散后進(jìn)入獨-立生存環(huán)境的變化過程。如果接種的細(xì)胞密度過大，會導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，代謝廢物積累較快需要經(jīng)常換液和傳代。

　　2）適當(dāng)增大原代培養(yǎng)接種的細(xì)胞密度，給培養(yǎng)的細(xì)胞提供geng多的類似于在體內(nèi)時細(xì)胞之間的相互作用，會極-大提高原代培養(yǎng)的細(xì)胞在體外存活率。待細(xì)胞適應(yīng)體外環(huán)境后進(jìn)行傳代培養(yǎng)時再以較低的密度接種和培養(yǎng)。

　　3）盡快使接種的細(xì)胞貼壁，是決定培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵?？梢栽诮臃N后先將培養(yǎng)瓶置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3h到5h，待細(xì)胞貼壁后，再補足培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

　　3、懸浮型原代細(xì)胞

　　1）必須保持細(xì)胞的懸浮狀態(tài)?？梢酝ㄟ^增加培養(yǎng)液的黏度來幫助細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，如給培養(yǎng)液中加入低濃度的透明質(zhì)酸復(fù)合物。在有攪拌裝置的培養(yǎng)器皿內(nèi)加入培養(yǎng)液，以5ml為低限度，否則攪拌時會產(chǎn)生氣泡對細(xì)胞造成傷害。使用這種方式需注意勿使攪拌速度過快，否則即可使培養(yǎng)液溢出又容易造成污染。如果培養(yǎng)液的量在5ml以下，可以采用旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。給懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞換液時要注意不要吸出細(xì)胞。

　　2）能夠進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，其生命力一般都比較旺盛，體外分裂增殖的速度較快，營養(yǎng)成分消耗大，換液時間隔一般較短。

　　原代細(xì)胞培養(yǎng)問題解答

　　1、原代細(xì)胞與細(xì)胞系有什么區(qū)別？

　　根據(jù)傳統(tǒng)定義，自組織第1次收獲和接種的細(xì)胞被稱為原代細(xì)胞[Freshney,R.I.(1987).Culture of Animal Cells.A Manual of Basic Technique.(New York,Alan R.Liss,Inc.)].這類細(xì)胞直接從組織分離，生命周期有限，經(jīng)數(shù)次傳代后會逐漸停止生長。原代細(xì)胞在有限的生命周期內(nèi)需掌握好細(xì)胞的-大生長空間，以保持細(xì)胞群中基因型和表型的一致性。

　　細(xì)胞系是不斷生長、分化的細(xì)胞群，因其經(jīng)過遺傳改造，致使其具有無限增長的潛能。體外生長的細(xì)胞系用于醫(yī)療或科研。

　　但實際上，經(jīng)過長時間、連續(xù)的傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞系隨著代數(shù)的增加，細(xì)胞的基因型和表型都有可能發(fā)生改變。

　　需要指出的是，在不同的科研小組中這些術(shù)語的定義會有所不同。許多研究員不用細(xì)胞系這個詞表示細(xì)胞群，除非細(xì)胞經(jīng)過了遺傳改造。

　　2、倍增和代數(shù)有什么區(qū)別？

　　倍增是培養(yǎng)物中細(xì)胞總數(shù)的翻倍，通常是指細(xì)胞指數(shù)或?qū)?shù)生長期。代數(shù)是指細(xì)胞群從培養(yǎng)瓶中移出，傳代培養(yǎng)過程的次數(shù)，傳代培養(yǎng)的目的，是使細(xì)胞處于低密度以刺激其進(jìn)一步生長。

　　3、接收到的凍存細(xì)胞該如何處理？

　　收到包裝箱后，立即將凍存細(xì)胞從干冰移入液氮中凍存。此過程盡量快，以避免升溫。不要將細(xì)胞儲存在-80℃，這樣會對細(xì)胞造成不可挽回的傷害。

　　4、凍存的細(xì)胞該如何開始培養(yǎng)？

　　(1)將一管細(xì)胞從液氮罐中取出，注意保護(hù)手和眼睛。

　　(2)將凍存管快速的放入37℃水浴中，輕輕握住并旋轉(zhuǎn)，直到管內(nèi)物體完quan融化。

　　(3)將凍存管立即從水浴中拿出，擦干，轉(zhuǎn)入無菌環(huán)境。

　　(4)用70％的酒精沖洗凍存管，然后擦去多余酒精。

　　(5)打開蓋子，注意手指不要碰到里面的螺紋（注意，由于凍存管有負(fù)壓，開蓋時可能會有少量溢出，這是正?，F(xiàn)象）。

　　(6)用多聚賴氨酸（或參照說明書）包被培養(yǎng)瓶。多數(shù)細(xì)胞推薦的接種密度為每平方厘米5000個細(xì)胞。

　　(7)蓋好培養(yǎng)瓶的蓋子，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶以使細(xì)胞分布均勻。若需要氣體交換可打開蓋子。

　　(8)將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中（37℃，5%CO2，95%空氣）

　　(9)放入培養(yǎng)箱后第6-16小時geng換一次培養(yǎng)基，以去除殘留的二甲基亞楓和未貼壁的細(xì)胞。

　　5、細(xì)胞培養(yǎng)過程中，多久geng換一次培養(yǎng)基？

　　這取決于細(xì)胞生長的速度。一般而言2-3天geng換一次培養(yǎng)基，許多細(xì)胞培養(yǎng)實驗室通常在周一，周三，周五geng換培養(yǎng)基。

　　注意：凍存細(xì)胞復(fù)蘇后，在6-16小時內(nèi)geng換培養(yǎng)基，以去除殘留的二甲基亞楓和死亡的細(xì)胞。

　　6、我能擴(kuò)增培養(yǎng)和再次凍存原代正常人類細(xì)胞嗎？

　　這取決于細(xì)胞的類型。一些細(xì)胞類型像神經(jīng)細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和一些生長緩慢的上皮細(xì)胞，不推薦擴(kuò)增培養(yǎng)和再次凍存。其它的細(xì)胞類型像成纖維細(xì)胞、星形細(xì)胞、腎系膜細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等等，可以擴(kuò)增培養(yǎng)和再次凍存。

　　然而，需要注意的是再次凍存的過程可能導(dǎo)致細(xì)胞生長性能的改變。

　　7、培養(yǎng)瓶中應(yīng)該加入多少體積的培養(yǎng)基？

　　我們推薦的用量為：T-25培養(yǎng)瓶5ml，T-75培養(yǎng)瓶15ml，T-150培養(yǎng)瓶30ml。

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