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1、核酸的定量
核酸的定量是超微量分光光度計(jì)使用頻率的功能??梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸,單鏈、雙鏈DNA,以及RNA。核酸的吸收峰的吸收波長(zhǎng)260nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一,因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸,事先要選擇對(duì)應(yīng)的系數(shù)。測(cè)試后的吸光值經(jīng)過(guò)上述系數(shù)的換算,從而得出相應(yīng)的樣品濃度。
2、核酸的純度檢測(cè)
除了核酸濃度,超微量分光光度計(jì)同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度,如:
(1)A260/A280的比值,用于評(píng)估樣品的純度,因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?80nm。純凈的樣品,比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8或者2.0,表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。
(2)A230表示樣品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,酚等,較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。
3、蛋白質(zhì)直接定量
這種方法是在280nm波長(zhǎng),直接測(cè)試蛋白。超微量分光光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度,或者是選擇相應(yīng)的換算方法,將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì),一般要消除320nm的"背景"信息,設(shè)定此功能"開(kāi)"。與測(cè)試核酸類似,要求A280的吸光值大于0.1A,的線性范圍在1.0-1.5之間。蛋白質(zhì)直接定量方法,適合測(cè)試較純凈、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對(duì)于比色法來(lái)說(shuō),速度快,操作簡(jiǎn)單;但是容易受到平行物質(zhì)的干擾,如DNA的干擾;另外敏感度低,要求蛋白的濃度較高。
4、比色法蛋白質(zhì)定量(顏色反應(yīng))
蛋白質(zhì)比色法測(cè)定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分:氨基酸與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng),產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān),從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。
比色方法一般有BCA,Bradford,Lowry等幾種方法。
由于各種方法反應(yīng)的基團(tuán)以及顯色基團(tuán)不一,所以同時(shí)使用幾種方法對(duì)同一樣品得出的樣品濃度無(wú)可比性。所以在選擇比色法之前,最好是參照要測(cè)試的樣本的化學(xué)構(gòu)成,尋找化學(xué)構(gòu)成類似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品。
5、OD600(菌落密度)
實(shí)驗(yàn)室確定細(xì)菌生長(zhǎng)密度和生長(zhǎng)期,多根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和目測(cè)推斷細(xì)菌的生長(zhǎng)密度。在遇到要求較高的實(shí)驗(yàn),需要采用分光光度計(jì)準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞密度。通過(guò)檢測(cè)600nm處細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)的吸光度,從而監(jiān)測(cè)微生物或其他細(xì)胞培養(yǎng)的生長(zhǎng)率。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長(zhǎng)的標(biāo)準(zhǔn)方法。實(shí)驗(yàn)中偶爾會(huì)出現(xiàn)菌液的OD值出現(xiàn)負(fù)值,原因是采用了顯色的培養(yǎng)基,即細(xì)菌培養(yǎng)一段時(shí)間后,與培養(yǎng)基反應(yīng),發(fā)生變色反應(yīng)。
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