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通過穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜手段深入探討單線態(tài)氧的發(fā)光特性

來源:北京卓立漢光儀器有限公司   2024年10月12日 16:24  

導言

對于單線態(tài)氧,可能很多人都感到很陌生。但是對于我們賴以生存的氧氣,卻再也熟悉不過。單線態(tài)氧是激發(fā)態(tài)的氧氣分子,參與生物體內很多重要的生物化學反應,它猶如一把雙*劍,既可以導致疾病的發(fā)生,又可以被人類應用在醫(yī)學治療、環(huán)境治理等領域??茖W家們正在積極研究單線態(tài)氧在各種生物化學反應中的動力學過程及機理, 試圖發(fā)掘出更多單線態(tài)氧可用于造福人類的潛能。

單線態(tài)氧是什么?

通常我們呼吸的氧氣分子性質穩(wěn)定,屬于三線態(tài)氧分子3O2,如果我們從微觀角度去看,氧氣分子中兩個自旋平行的電子分別占據兩個2pπ*軌道,自旋多重性為3,稱為三線態(tài)。當基態(tài)氧原子被激發(fā)后,原本兩個2pπ*軌道中兩個自旋平行的電子,既可以自旋相反地同時占據一個2pπ*軌道,也可以分別占據兩個2pπ*軌道。這兩種分子激發(fā)態(tài)下的自旋多重性均為1,也就是接下來要介紹的單線態(tài)氧分子1O2。

圖1. 不同氧氣分子的分子軌道能級圖

從分子軌道上的電子分布可以看到,單線態(tài)氧由于解除了自旋限制,化學性質更活潑。它是一種含氧的非自由基活性物種,具有強氧化性,可以高選擇性奪取電子。多年的研究表明,單線態(tài)氧在酶反應、細胞分裂、機體衰老、腫瘤等過程中都有參與作用。在一般情況下,細胞內單線態(tài)氧的濃度很低,而且單線態(tài)氧的產生和清除處于一個平衡的狀態(tài),不會引起機體損傷。但是如果由于某種誘因,導致這種平衡被破壞,就可能引起膜脂過氧化,嚴重時導致細胞死亡。此外,高活性的單線態(tài)氧也是一些化學和生物反應過程中重要的中間體,如光氧化反應[1],光敏細胞毒性[2],光動力學治療[3,4]等。單線態(tài)氧產生機制對光動力療法、抗癌藥物和其他皮膚治療的研究也都很重要。

單線態(tài)氧的產生可借助于光敏劑實現。光敏劑分子在氧氣中被光輻照后,其激發(fā)三重態(tài)與基態(tài)氧發(fā)生反應,從而產生激發(fā)態(tài)的單線態(tài)氧。這些光敏劑包括玫瑰紅、過渡金屬絡合物、卟啉、熒光素等。

圖2. 光敏劑作用下單線態(tài)氧產生過程示意圖

單線態(tài)氧的測量

目前探測單線態(tài)氧的方法主要有順磁共振、熒光光譜法、化學捕獲吸光度法、化學發(fā)光法、熒光探針法等。其中熒光光譜法已經成為檢測單線態(tài)氧的常用手段。單線態(tài)氧的輻射復合發(fā)光位于1270nm,遠遠超出了人眼的可見波長范圍,且其發(fā)光較弱,需要使用靈敏度較高的近紅外探測器才可以檢測到。近年來隨著近紅外探測器性能逐漸提高,可選激發(fā)光源也越來越多,為單線態(tài)氧的檢測提供了很大的幫助。

本文采用卓立漢光公司的穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜儀OmniFluo990 對光敏劑孟加拉玫瑰紅在光照下與氧氣反應所產生的單線態(tài)氧進行測量,激發(fā)光源為532nm激光器,具有連續(xù)輸出和脈沖輸出兩種模式。單線態(tài)氧的發(fā)射光譜分別采用卓立漢光的近紅外InGAs探測器(型號:DInGaAs1700-03M)和濱松的近紅外PMT(型號:R5509-73)測試得到。

實驗樣品準備:把孟加拉玫瑰紅(Rose Bengal ,C20H2Cl4I4Na2O5)溶于分析純無水乙腈,測試之前,在溶液中通入氧氣飽和10分鐘。單線態(tài)氧

穩(wěn)態(tài)發(fā)光測試

穩(wěn)態(tài)光譜測試使用532nm激光器,能量為80mW。發(fā)射側光柵刻線密度為600g/mm,閃耀波長為750nm。掃描范圍設置為1220-1340nm,步長1nm,帶寬3nm,積分時間200ms,重復5次。發(fā)射側使用800nm高通濾光片消除倍頻峰信號干擾。近紅外R5509-73 PMT在1274 nm處測到單線態(tài)氧的發(fā)光峰,如圖3所示。

圖3. 單線態(tài)氧穩(wěn)態(tài)光譜圖(采用R5509 PMT)

圖4為使用卓立漢光近紅外InGaAs檢測器測試得到的結果。InGaAs為模擬信號檢測器,靈敏度要比PMT低,圖中可見單線態(tài)氧的發(fā)光峰信號強度相比NIR PMT要弱,譜線噪聲也略大。盡管如此,我們依然可以看到很明顯的單線態(tài)氧發(fā)光信號,包括峰位也和近紅外PMT結果一致。

圖4單線態(tài)氧穩(wěn)態(tài)光譜圖(采用InGaAs檢測器)

瞬態(tài)發(fā)光測試

發(fā)光壽命測試對從機理上研究單線態(tài)氧所參與的眾多光生物和光化學過程來說,具有重要的參考價值。單線態(tài)氧的壽命會受到光敏劑以及溶劑的影響,研究表明溶劑對其壽命的影響更大。單線態(tài)氧在溶液中很容易被多種溶劑淬滅,具有很強的溶劑依賴性。其中水就是一種*容易使單線態(tài)氧淬滅的溶劑,因為水中O-H鍵容易與單線態(tài)氧發(fā)生耦合反應。因此,本次實驗中所采用的乙腈為分析純的無水乙腈,避免單線態(tài)氧的信號被水淬滅。

本次實驗所采用的瞬態(tài)光譜激發(fā)光源為532nm激光器,經過調制得到脈沖激光,檢測器使用近紅外R5509-73 PMT。圖5數據經過擬合,得到單線態(tài)氧壽命為60.7μs。

圖5. 單線態(tài)氧發(fā)光壽命測試(采用R5509 PMT)

單線態(tài)氧測試推薦儀器:

OmniFluo900穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜儀

配置推薦:

激發(fā)光源:532nm激光器,連續(xù)輸出和脈沖輸出兩種模式可調
檢測器:近紅外檢測器,可選卓立漢光自制InGaAs(型號:DInGaAs1700-03M)或者濱松的近紅外PMT(型號:R5509-73)
發(fā)射單色器:標配三光柵塔輪,可安裝多至三塊光柵,其中近紅外光柵可用于單線態(tài)氧近紅外發(fā)光的分光。自動濾光片輪,用于安裝800nm高通濾光片,消除倍頻峰信號對單線態(tài)氧發(fā)光峰的干擾

參考文獻

(1) Braun, A. M.; Maurette, M. T.; Oliveros, E. Photochemical Technology; Wiley: Chichester, U.K. 1991; pp 445-499.

(2) Cadenas, E. Annu. ReV. Biochem. 1989, 58, 79-110.

(3) Dougherty, T. J.; Gomer, C. J.; Henderson, B. W.; Jori, G.; Kessel, D.; Korbelik, M.; Moan, J.; Peng, Q. J. Nat. Cancer Inst. 1998, 90, 889-905.

(4) Ali, H.; an Lier, J. E. Chem. ReV. 1999, 9, 2379-2450.

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