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凝膠電泳儀通常用于分析用途,但也可以作為制備技術(shù),在采用某些方法(如質(zhì)譜(MS)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、克隆技術(shù)、DNA測(cè)序或者免疫印跡)檢測(cè)之前部分提純分子。
一、使用方法
該技術(shù)操作簡(jiǎn)便快速,可以分辨用其它方法(如密度梯度離心法)所無(wú)法分離的DNA片段。當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidiumbromide,EB)染色,在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶,從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外,還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶,用于以后的克隆技術(shù)操作。
二、產(chǎn)品應(yīng)用
凝膠電泳被廣泛用于分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和生物化學(xué):1.大的DNA或者RNA分子通常利用瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis)分離,也可以使用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。2.蛋白質(zhì)的凝膠電泳通常在加入十二烷基硫酸鈉的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行(SDS-PAGE),或者非變性凝膠電泳,或二維電泳。SDS-PAGE蛋白質(zhì)凝膠電泳圖。3.毛細(xì)管電泳。4.酶譜法(zymography)。5.變性梯度膠凝電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE)。瓊脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長(zhǎng)度從200bp至近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場(chǎng)下電泳。聚丙烯酰胺分離小片段DNA(5-500bp)效果較好,其分辯力*,甚至相差1bp的DNA片段就能分開(kāi)。聚丙烯酰胺凝膠電泳很快,可容納相對(duì)大量的DNA,但制備和操作比瓊脂糖凝膠困難。聚丙烯酰胺凝膠采用垂直裝置進(jìn)行電泳。目前,一般實(shí)驗(yàn)室多用瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進(jìn)行DNA電泳。
瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì),其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場(chǎng)中,在中性pH值下帶負(fù)電荷的DNA向陽(yáng)極遷移,其遷移速率由下列多種因素決定:
1、DNA的分子大?。壕€狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對(duì)數(shù)成反比,分子越大則所受阻力越大,也越難于在凝膠孔隙中蠕行,因而遷移得越慢。
2、瓊脂糖濃度
一個(gè)給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對(duì)數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%,分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%,DNA片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。
3、DNA分子的構(gòu)象
DNA分子處于不同構(gòu)象時(shí),它在電場(chǎng)中移動(dòng)距離不僅和分子量有關(guān),還和它本身構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開(kāi)環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)速度是不一樣的,超螺旋DNA移動(dòng)zui快,而開(kāi)環(huán)雙鏈DNA移動(dòng)zui慢。如在電泳鑒定質(zhì)粒純度時(shí)發(fā)現(xiàn)凝膠上有數(shù)條DNA帶難以確定是質(zhì)粒DNA不同構(gòu)象引起還是因?yàn)楹衅渌鸇NA引起時(shí),可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個(gè)回收,用同一種限制性?xún)?nèi)切酶分別水解,然后電泳,如在凝膠上出現(xiàn)相同的DNA圖譜,則為同一種DNA。
三、維護(hù)與保養(yǎng)
電泳儀通電進(jìn)入工作狀態(tài)后,禁止人體接觸電極、電泳儀電泳物及其它可能帶電部分,也不能到電泳儀電泳槽內(nèi)取放東西,如需要應(yīng)先斷電,以免觸電。同時(shí)要求電泳儀必須有良好接地端,以防漏電。
電泳儀通電后,不要臨時(shí)增加或撥除輸出導(dǎo)線插頭,以防短路現(xiàn)象發(fā)生,雖然電泳儀內(nèi)部附設(shè)有保險(xiǎn)絲,但短路現(xiàn)象仍有可能導(dǎo)致電泳儀損壞。
由于電泳儀不同介質(zhì)支持物的電阻值不同,電泳儀電泳時(shí)所通過(guò)的電流量也不同,其電泳儀泳動(dòng)速度及泳至終點(diǎn)所需時(shí)間也不同,故電泳儀不同介質(zhì)支持物的電泳不要同時(shí)在同一電泳儀上進(jìn)行。
在總電流不超過(guò)電泳儀額定電流時(shí)(zui大電流范圍),可以多槽關(guān)聯(lián)使用,但要注意不能超載,否則容易影響電泳儀壽命。
某些特殊情況下需檢查電泳儀電泳輸入情況時(shí),允許在穩(wěn)壓狀態(tài)下空載開(kāi)機(jī),但在穩(wěn)流狀態(tài)下必須先接好負(fù)載再開(kāi)機(jī),否則電壓表指針將大幅度跳動(dòng),容易造成不必要的人為電泳儀損壞。
使用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)電泳儀異?,F(xiàn)象,如較大噪音、放電或異常氣味,須立即切斷電泳儀電源,進(jìn)行檢修,以免發(fā)生意外事故。
一、使用方法
該技術(shù)操作簡(jiǎn)便快速,可以分辨用其它方法(如密度梯度離心法)所無(wú)法分離的DNA片段。當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidiumbromide,EB)染色,在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶,從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外,還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶,用于以后的克隆技術(shù)操作。
二、產(chǎn)品應(yīng)用
凝膠電泳被廣泛用于分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和生物化學(xué):1.大的DNA或者RNA分子通常利用瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis)分離,也可以使用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。2.蛋白質(zhì)的凝膠電泳通常在加入十二烷基硫酸鈉的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行(SDS-PAGE),或者非變性凝膠電泳,或二維電泳。SDS-PAGE蛋白質(zhì)凝膠電泳圖。3.毛細(xì)管電泳。4.酶譜法(zymography)。5.變性梯度膠凝電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE)。瓊脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長(zhǎng)度從200bp至近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場(chǎng)下電泳。聚丙烯酰胺分離小片段DNA(5-500bp)效果較好,其分辯力*,甚至相差1bp的DNA片段就能分開(kāi)。聚丙烯酰胺凝膠電泳很快,可容納相對(duì)大量的DNA,但制備和操作比瓊脂糖凝膠困難。聚丙烯酰胺凝膠采用垂直裝置進(jìn)行電泳。目前,一般實(shí)驗(yàn)室多用瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進(jìn)行DNA電泳。
瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì),其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場(chǎng)中,在中性pH值下帶負(fù)電荷的DNA向陽(yáng)極遷移,其遷移速率由下列多種因素決定:
1、DNA的分子大?。壕€狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對(duì)數(shù)成反比,分子越大則所受阻力越大,也越難于在凝膠孔隙中蠕行,因而遷移得越慢。
2、瓊脂糖濃度
一個(gè)給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對(duì)數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%,分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%,DNA片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。
3、DNA分子的構(gòu)象
DNA分子處于不同構(gòu)象時(shí),它在電場(chǎng)中移動(dòng)距離不僅和分子量有關(guān),還和它本身構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開(kāi)環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)速度是不一樣的,超螺旋DNA移動(dòng)zui快,而開(kāi)環(huán)雙鏈DNA移動(dòng)zui慢。如在電泳鑒定質(zhì)粒純度時(shí)發(fā)現(xiàn)凝膠上有數(shù)條DNA帶難以確定是質(zhì)粒DNA不同構(gòu)象引起還是因?yàn)楹衅渌鸇NA引起時(shí),可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個(gè)回收,用同一種限制性?xún)?nèi)切酶分別水解,然后電泳,如在凝膠上出現(xiàn)相同的DNA圖譜,則為同一種DNA。
三、維護(hù)與保養(yǎng)
電泳儀通電進(jìn)入工作狀態(tài)后,禁止人體接觸電極、電泳儀電泳物及其它可能帶電部分,也不能到電泳儀電泳槽內(nèi)取放東西,如需要應(yīng)先斷電,以免觸電。同時(shí)要求電泳儀必須有良好接地端,以防漏電。
電泳儀通電后,不要臨時(shí)增加或撥除輸出導(dǎo)線插頭,以防短路現(xiàn)象發(fā)生,雖然電泳儀內(nèi)部附設(shè)有保險(xiǎn)絲,但短路現(xiàn)象仍有可能導(dǎo)致電泳儀損壞。
由于電泳儀不同介質(zhì)支持物的電阻值不同,電泳儀電泳時(shí)所通過(guò)的電流量也不同,其電泳儀泳動(dòng)速度及泳至終點(diǎn)所需時(shí)間也不同,故電泳儀不同介質(zhì)支持物的電泳不要同時(shí)在同一電泳儀上進(jìn)行。
在總電流不超過(guò)電泳儀額定電流時(shí)(zui大電流范圍),可以多槽關(guān)聯(lián)使用,但要注意不能超載,否則容易影響電泳儀壽命。
某些特殊情況下需檢查電泳儀電泳輸入情況時(shí),允許在穩(wěn)壓狀態(tài)下空載開(kāi)機(jī),但在穩(wěn)流狀態(tài)下必須先接好負(fù)載再開(kāi)機(jī),否則電壓表指針將大幅度跳動(dòng),容易造成不必要的人為電泳儀損壞。
使用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)電泳儀異?,F(xiàn)象,如較大噪音、放電或異常氣味,須立即切斷電泳儀電源,進(jìn)行檢修,以免發(fā)生意外事故。
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首屆分析科學(xué)與儀器大會(huì)
展會(huì)城市:成都市展會(huì)時(shí)間:2024-11-08