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染色的基本原理、方法及注意事項(xiàng)

來(lái)源: 上海古朵生物科技有限公司    2020年01月06日 09:22  
  涂片及染色是微生物學(xué)的基本技術(shù),也是觀察細(xì)菌Z簡(jiǎn)單且行之有效的方法。通常情況下,由于細(xì)菌個(gè)體較小,較透明或半透明,如未經(jīng)染色往往不易觀察識(shí)別。因此借助于染色法可使細(xì)菌著色,與視野背景形成鮮明對(duì)比,從而易于在顯微鏡下進(jìn)行觀察。
 
  簡(jiǎn)單染色法即只用一種染料對(duì)涂片進(jìn)行染色,該法簡(jiǎn)便易行,適用于菌體的一般形態(tài)觀察。通常情況下由于細(xì)菌菌體多帶負(fù)電荷,易和帶正電荷的堿性染料結(jié)合而被染色,因此常用堿性染料進(jìn)行簡(jiǎn)單染色,如美藍(lán)、堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫、孔雀綠、番紅等。所有的苯胺染料,均可用來(lái)做簡(jiǎn)單染色法的染色劑。在進(jìn)行染色之前的制片過(guò)程是影響染色結(jié)果好壞的關(guān)鍵性步驟。
 
  制備細(xì)菌染色片一般要經(jīng)過(guò)涂片、固定、染色、水洗、干燥等步驟(見(jiàn)下圖),然后用顯微鏡,甚至油鏡觀察。
 
(一)涂片
 
  取一干凈的載玻片,滴加一小滴蒸餾水于載玻片*。按無(wú)菌操作要求,接種環(huán)經(jīng)灼燒滅菌,待冷卻后用接種環(huán)從菌種試管斜面上(培養(yǎng)皿表面)挑取少量培養(yǎng)物(不要挑破培養(yǎng)基),置于載玻片上的水滴中,與水混合并輕輕涂布成直徑約1cm左右的均勻薄層。操作完成后,接種環(huán)要再經(jīng)灼燒滅菌,放歸原處。
 
  (二)干燥
 
  將涂片于室溫中自然干燥或者置于酒精燈火焰高處,微熱烘干。切記不能直接在火焰上烘烤,以免菌體烤焦變形,影響對(duì)菌體的觀察。
 
  (三) 固定
 
  涂片標(biāo)本面向上,快速通過(guò)酒精燈火焰外焰2次~3次,進(jìn)行標(biāo)本固定。固定的目的在于殺死細(xì)菌以固定其細(xì)胞結(jié)構(gòu);保證菌體牢固地粘附在載玻片上,染色或水洗時(shí)不至于脫落;同時(shí)改變菌體對(duì)染料的通透性,有利于著色,增強(qiáng)染色效果。固定時(shí),以載玻片背面加熱處觸及皮膚而不覺(jué)過(guò)燙為宜(一般不超過(guò)60 ℃ )。
 
  (四)染色
 
  標(biāo)本玻片水平放置,滴加1滴~2滴染色液,使染色液*覆蓋涂片區(qū)域,染色時(shí)間視不同標(biāo)本和染料的性質(zhì)而定。
 
  (五)水洗
 
  染色到一定時(shí)間后,傾去染液,斜置玻片, 自玻片上端用自來(lái)水沖洗至流下的水無(wú)色為止;或?qū)⒉F糜诓F苌?,用洗瓶?jī)A注水流進(jìn)行水洗。注意沖洗水流不宜過(guò)急、過(guò)大,同時(shí)要避免直接沖在涂片處,導(dǎo)致涂片受損。
 
  (六)干燥、鏡檢
 
  自然晾干,或用吸水紙吸去玻片上的多余水分后再晾干,但要注意勿將菌體抹掉。*干燥后,用顯微鏡甚至油鏡檢查。
 
  注意事項(xiàng):
 
  (1)載玻片要清潔無(wú)油污,否則菌液不易涂開。涂片時(shí)取培養(yǎng)物宜少,培養(yǎng)物涂層宜薄,涂層過(guò)厚則不易觀察細(xì)菌形態(tài)。
 
  (2)干燥和固定時(shí),玻片不能直接在離火焰很近的位置上烘烤,否則會(huì)破壞細(xì)菌形態(tài)并使之變形,影響觀察結(jié)果。
 
  (3)觀察時(shí)如需用到油鏡,油鏡檢查前玻片應(yīng)*干燥,觀察后要將油鏡用擦鏡紙等*擦拭干凈。

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