自噬是近年來很熱門的領(lǐng)域，很多人傻傻分不清自噬和死亡。

 自噬的過程——從一張圖開始

 步驟 1：細(xì)胞接受自噬誘導(dǎo)信號(hào)后，在胞漿的某處形成一個(gè)小的類似「脂質(zhì)體」樣的膜結(jié)構(gòu)，然后不斷擴(kuò)張，但它并不呈球形，而是扁平的，就像一個(gè)由 2 層脂雙層組成的碗，可在電鏡下觀察到，被稱為 Phagophore，是自噬發(fā)生的鐵證之一。

 步驟 2： Phagophore 不斷延伸，將胞漿中的任何成分，包括細(xì)胞器，全部攬入「碗」中，然后「收口」，成為密閉的球狀的「自噬體」，即 autophagosome。電鏡下觀察到自噬體是自噬發(fā)生的鐵證之二。有 2 個(gè)特征：一是雙層膜，二是內(nèi)含胞漿成分，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)碎片等。

 步驟  3：自噬體形成后，可與細(xì)胞內(nèi)吞的吞噬泡、吞飲泡和內(nèi)體融合（加了個(gè)「可」字，意思是這種情況不是必然要發(fā)生的）。

 步驟 4：自噬體與溶酶體融合形成 autolysosome，期間自噬體的內(nèi)膜被溶酶體酶降解，二者的內(nèi)容物合為一體，自噬體中的「貨物」也被降解，產(chǎn)物（氨基酸、脂肪酸等）被輸送到胞漿中，供細(xì)胞重新利用，而殘?jiān)虮慌懦黾?xì)胞外或滯留在胞漿中。

自噬的研究方法

正常培養(yǎng)的細(xì)胞自噬活性很低，不適于觀察，因此，必須對(duì)自噬進(jìn)行人工干預(yù)和調(diào)節(jié)，經(jīng)報(bào)道的工具藥有：

1.  自噬誘導(dǎo)劑

Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模擬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化鋰）：IMPase 抑制劑（即 Inositol monophosphatase，肌醇單磷酸酶）

Earle's *：制造饑餓

N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway 抑制劑

Rapamycin：mTOR 抑制劑

Xestospongin B/C：IP3R 阻滯劑

2.  自噬抑制劑 

3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K）hVps34 抑制劑

Bafilomycin A1：質(zhì)子泵抑制劑

Hydroxychloroquine（*）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶體腔堿化劑）

除了選用上述工具藥外，一般還需結(jié)合遺傳學(xué)技術(shù)對(duì)自噬相關(guān)基因進(jìn)行干預(yù)：包括反義 RNA 干擾技術(shù)（Knockdown）、突變株篩選、外源基因?qū)氲取?/p>

自噬的觀察與檢測(cè)

細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)或抑制后，需對(duì)自噬過程進(jìn)行觀察和檢測(cè)，常用的策略和技術(shù)有：

1. 觀察自噬體的形成

由于自噬體屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。Phagophore 的特征為：新月狀或杯狀，雙層或多層膜，有包繞胞漿成分的趨勢(shì)。

自噬體（AV1）的特征為：雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含胞漿成分，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等。

自噬溶酶體（AV2）的特征為：?jiǎn)螌幽?，胞漿成分已降解。（autophagic vacuole，AV）

2. 在熒光顯微鏡下采用 GFP-LC3 融合蛋白來示蹤自噬形成

由于電鏡耗時(shí)長(zhǎng)，不利于監(jiān)測(cè)（Monitoring）自噬形成，人們利用 LC3 在自噬形成過程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象開發(fā)出了此技術(shù)。無自噬時(shí)，GFP-LC3 融合蛋白彌散在胞漿中；自噬形成時(shí)，GFP-LC3 融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn)，一個(gè)斑點(diǎn)相當(dāng)于一個(gè)自噬體，可以通過計(jì)數(shù)來評(píng)價(jià)自噬活性的高低。

3. 利用 Western Blot 檢測(cè) LC3-II/I 比值的變化以評(píng)價(jià)自噬形成

自噬形成時(shí)，胞漿型 LC3（即 LC3-I）會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄗ允审w）膜型（即 LC3-II），因此，LC3-II/I 比值的大小可估計(jì)自噬水平的高低。

LC3 抗體對(duì) LC3-II 有更高的親和力，會(huì)造成假陽性。方法 2 和 3 需結(jié)合使用，同時(shí)需考慮溶酶體活性的影響。

4.  MDC 染色

MDC 染色即 Monodansylcadaverine，單丹磺酰尸胺染色，包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特異性的。

5. CellTrackerTM Green 染色

主要用于雙染色，但其能染所有的液泡，故也屬于非特異性的。

自噬相關(guān)蛋白定位

在研究自噬相關(guān)蛋白時(shí)，需對(duì)其進(jìn)行定位。由于自噬體與溶酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體關(guān)系密切，為了區(qū)別，常用到一些示蹤蛋白在熒光顯微鏡下來共定位：

Lamp-2：溶酶體膜蛋白，可用于監(jiān)測(cè)自噬體與溶酶體融合。
LysoTrackerTM 探針：有紅或藍(lán)色可選，顯示所有酸性液泡。
pDsRed2-mito：載體，轉(zhuǎn)染后表達(dá)一個(gè)融合蛋白（紅色熒光蛋白+線粒體基質(zhì)定位信號(hào)），可用來檢測(cè)線粒體被自噬掉的程度（Mitophagy）。
MitoTraker 探針：特異性顯示活的線粒體，熒光在經(jīng)過固定后還能保留。
Hsp60：定位與線粒體基質(zhì)，細(xì)胞死亡時(shí)不會(huì)被釋放。
Calreticulin（鈣網(wǎng)織蛋白）：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔。

Note：這些蛋白均為胞漿蛋白，爬片或*消化的細(xì)胞在做免疫熒光前需先透膜（permeablize），可采用 0.1% SDS 處理。